胰島素、瘦素對(duì)大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的調(diào)節(jié)及機(jī)制.pdf

1、下丘腦是神經(jīng)-內(nèi)分泌兩大機(jī)能系統(tǒng)的結(jié)合點(diǎn)，在維持機(jī)體生命活動(dòng)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要的作用。由脂肪細(xì)胞分泌的瘦素（leptin）與胰島β細(xì)胞分泌的胰島素（insulin）在下丘腦的神經(jīng)-內(nèi)分泌反饋環(huán)路中起到將外周信號(hào)傳入下丘腦的作用。它們作用于下丘腦中樞，通過(guò)改變神經(jīng)元的電興奮性來(lái)調(diào)節(jié)某些特定的效應(yīng)神經(jīng)元，如神經(jīng)肽Y（NPY）神經(jīng)元的生理功能。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large conductance calcium-activated pot

2、assium channels，BK通道）是眾多K+通道中的一種，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中廣泛分布于樹(shù)突，軸突，突觸末端，以及神經(jīng)元胞體。在細(xì)胞發(fā)生動(dòng)作電位期間，通道可以被膜的去極化和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的增高所激活，其直接效應(yīng)是產(chǎn)生快后超極化電位。因此，通道的作用主要是使神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏臅r(shí)程維持在正常范圍內(nèi)，使神經(jīng)元放電頻率減少，降低神經(jīng)元的興奮性，從而最終影響神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。通道功能特性的改變，將對(duì)神經(jīng)元的活動(dòng)和腦

3、的正常功能產(chǎn)生重要影響。然而，下丘腦內(nèi)NPY神經(jīng)元散在分布的特點(diǎn)使得很難對(duì)單個(gè)神經(jīng)元電生理活動(dòng)進(jìn)行觀察。為了研究這一類(lèi)神經(jīng)元的內(nèi)在活動(dòng)及其對(duì)insulin和leptin的電生理反應(yīng)，通過(guò)建立將形態(tài)學(xué)特征與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法來(lái)鑒定NPY神經(jīng)元，并運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究insulin和leptin對(duì)BK通道的作用及其機(jī)制。 第一部分、Insulin對(duì)培養(yǎng)大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元BK通道的影響及機(jī)制。 目的：NPY

4、神經(jīng)元是下丘腦內(nèi)調(diào)節(jié)攝食和能量代謝的主要效應(yīng)細(xì)胞，大量研究已證實(shí)，insulin能夠抑制NPY神經(jīng)元的活性。BK通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞興奮性上發(fā)揮了重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究insulin對(duì)NPY神經(jīng)元BK通道的作用，探討insulin調(diào)控這類(lèi)神經(jīng)元興奮性的電生理機(jī)制。 方法： （1）采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定與攝食相關(guān)的NPY神經(jīng)元。 （2）結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)及及記錄后的再次鑒定比對(duì)，研究insuli

5、n對(duì)這類(lèi)神經(jīng)元BK通道的調(diào)節(jié)作用及其可能的信號(hào)通路。 結(jié)果： （1）NPY神經(jīng)元具有明顯形態(tài)學(xué)特征，典型的NPY神經(jīng)元細(xì)胞體較小，成三角形或紡錘形，大部分具有1-3個(gè)細(xì)小的，不分枝的一級(jí)樹(shù)突。 （2）Insulin （0.1-30 nM）濃度依賴性地增加BK電流。3nM insulin在膜電位為+20-+60mV時(shí)可使BK電流的I-V曲線顯著上移，并且能夠使BK通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線左移。 （3）Insuli

6、n對(duì)BK電流的增大作用能夠被其受體阻斷劑以及磷脂酰肌醇3激酶（PI3-k）阻斷劑所抑制，而不受絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）阻斷劑的影響。 結(jié)論：Insulin可濃度依賴性地增加BK通道電流，且這種作用是通過(guò)IR介導(dǎo)的PI3-k途徑實(shí)現(xiàn)。 第二部分、Leptin對(duì)培養(yǎng)大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元BK通道的影響及機(jī)制。 目的：生理狀態(tài)下，leptin發(fā)揮著與insulin相似的功能，CNS中l(wèi)eptin同樣能夠抑制NPY

7、神經(jīng)元的活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究leptin對(duì)NPY神經(jīng)元BK通道的作用，探討leptin調(diào)控這類(lèi)神經(jīng)元興奮性的電生理機(jī)制，觀察leptin對(duì)NPY神經(jīng)元BK通道的作用是否與insulin類(lèi)似。 方法： （1）采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定NPY神經(jīng)元。 （2）結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)及及記錄后的再次鑒定比對(duì)，研究leptin對(duì)這類(lèi)神經(jīng)元BK通道的調(diào)節(jié)作用及其信號(hào)通路。 結(jié)果： （1）Lepti

8、n對(duì)NPY神經(jīng)元BK通道的影響與insulin極其類(lèi)似。Leptin（1.0-300nM）濃度依賴性地增加NPY神經(jīng)元BK電流。30nM leptin在膜電位為+20 mV-+60 mV時(shí)可使BK電流的I-V曲線顯著上移，而對(duì)通道的電壓依賴的激活特性以及激活閾電位沒(méi)有影響。30nM leptin還能夠使BK通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線左移，而對(duì)曲線斜率沒(méi)有顯著影響。 （2）leptin受體（LEPR）-門(mén)神激酶2（JAK2）-PI3-k信

9、號(hào)通路阻斷劑能夠抑制leptin引起的NPY神經(jīng)元BK電流的增大，而MAPK阻斷劑則不產(chǎn)生影響。 結(jié)論：Leptin可濃度依賴性地增加BK通道電流，且這種作用是通過(guò)LEPR介導(dǎo)的PI3-k途徑實(shí)現(xiàn)。 第三部分、Insulin及l(fā)eptin對(duì)培養(yǎng)大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元BK通道的相互作用。 目的：生理環(huán)境中，insulin和leptin共同存在于下丘腦部位發(fā)揮生理作用，且大量研究表明這兩類(lèi)激素在下丘腦的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之

10、間存在著交叉對(duì)話。因此本實(shí)驗(yàn)觀察insulin和leptin共同存在時(shí)對(duì)NPY神經(jīng)元BK通道的作用，以及激素之間的相互影響。 方法： （1）采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定NPY神經(jīng)元。 （2）結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)及記錄后的再次鑒定比對(duì)，研究insulin和leptin共同作用于NPY神經(jīng)元BK通道的效果以及一種激素預(yù)孵育是否會(huì)對(duì)另一種激素的作用產(chǎn)生影響。 結(jié)果： （1）外液中同時(shí)加入3n

11、M insulin和30nM leptin顯著增大NPY神經(jīng)元BK電流幅值，且增大作用同樣可以被PI3-k阻斷劑抑制。然而兩種激素共同作用的效果與3nM insulin或30nM leptin單獨(dú)作用時(shí)的效果相近，并未出現(xiàn)疊加效應(yīng)。 （2）3nM insulin預(yù)孵育神經(jīng)元5min后再觀察30nM leptin對(duì)BK電流的作用，發(fā)現(xiàn)insulin預(yù)孵育后的神經(jīng)元對(duì)leptin失去反應(yīng)性。同樣，用30nM leptin預(yù)孵育的神經(jīng)