氯化鑭對(duì)神經(jīng)元的毒性作用及可能機(jī)制研究.pdf

1、我國(guó)是世界上稀土儲(chǔ)量和產(chǎn)量最多的國(guó)家，稀土已在各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，由此不可避免地通過(guò)各種途徑進(jìn)入動(dòng)物和人體，因此研究稀土元素對(duì)動(dòng)物和人體生理功能的影響及其機(jī)制，探明稀土元素的安全攝入量，已成為研究者關(guān)注的課題。
　　 有研究表明稀土具有神經(jīng)毒性，高級(jí)神經(jīng)中樞對(duì)其毒性較其他器官更敏感。贛南稀土礦區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，該地區(qū)兒童認(rèn)知和感知運(yùn)動(dòng)行為能力以及學(xué)習(xí)能力降低，提示長(zhǎng)期攝入低劑量稀土影響大腦功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料表明，稀土可通過(guò)

2、血腦屏障并在腦組織蓄積，并通過(guò)影響神經(jīng)細(xì)胞代謝活力；影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放和攝??；損傷海馬區(qū)域結(jié)構(gòu)促使細(xì)胞凋亡等途徑影響學(xué)習(xí)記憶。
　　 鑭是輕稀土的代表，化學(xué)性質(zhì)較活潑，其離子半徑與Ca2+相似。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鑭不影響小鼠皮層細(xì)胞的代謝活力，但3.0mmol/L鑭可直接升高鈣熒光比值，并加劇谷氨酸的興奮性神經(jīng)毒性損傷。本室既往研究也證實(shí)了1.0％氯化鑭飲水組大鼠子鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，海馬神經(jīng)元凋亡率顯著增加，學(xué)習(xí)記憶能

3、力下降。本研究對(duì)體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行氯化鑭染毒處理，觀察不同劑量鑭暴露對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度、胞漿及線粒體細(xì)胞色素c含量、caspase-3表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡的影響，探討氯化鑭對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)分組
　　 根據(jù)LaCl3濃度分為四組，分別為0.01，0.1，1.0，2.0mmol/L，用無(wú)血清DMEM作為對(duì)照組，無(wú)血清DMEM配制LaCl3。
　　 研究方法：
　　 1、神經(jīng)元

4、的鑒定 NSE免疫細(xì)胞化學(xué)法
　　 2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡
　　 3、細(xì)胞存活率測(cè)定 MTT法
　　 4、細(xì)胞凋亡檢測(cè) 流式細(xì)胞儀法
　　 5、細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度測(cè)定 Fura-2/AM熒光探針?lè)?br>　　 6、胞漿和線粒體中細(xì)胞色素c含量測(cè)定 化學(xué)比色法
　　 7、caspase-3活性測(cè)定 Western-Blot法
　　 結(jié)果：
　　 1、神經(jīng)元的鑒定
　

5、　 NSE免疫組化后，以在細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為陽(yáng)性，每張爬片隨機(jī)選取10個(gè)視野，以其中陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目占總細(xì)胞的比例作為神經(jīng)元純度，經(jīng)鑒定神經(jīng)元的純度為90％以上。
　　 2、細(xì)胞存活率
　　 氯化鑭對(duì)神經(jīng)元有一定的細(xì)胞毒性，各劑量組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01），且隨暴露濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，存在一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，且在1.0mmol/L時(shí)細(xì)胞半數(shù)受抑。
　　 3、細(xì)胞

6、凋亡檢測(cè)
　　 隨氯化鑭濃度的增大，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，除0.01mmol/L劑量組外，氯化鑭暴露組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比均顯著升高（p<0.01）。
　　 4、細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的變化
　　 鑭暴露組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i顯著升高，與對(duì)照組差異明顯（p<0.05或0.01），并隨鑭暴露濃度的增大而升高，各劑量組間差異亦明顯（p<0.05或0.01）。
　　 5、線粒體和胞漿中細(xì)胞色素c含量變化

7、r>　　 鑭暴露各組神經(jīng)元線粒體中細(xì)胞色素c含量降低，胞漿中細(xì)胞色素c含量升高，與對(duì)照組比較差異顯著（p<0.05），并且隨染毒濃度的增加而呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系。
　　 6、caspase-3蛋白表達(dá)變化
　　 隨著LaCl3濃度的增大，procaspase-3（32kD）表達(dá)逐漸減少，說(shuō)明活化的caspase-3蛋白逐漸增多，且0.1和1.0mM劑量組與對(duì)照組差異明顯（p<0.05）。
　　 結(jié)論：