蝦肝腸胞蟲實時熒光定量PCR檢測技術(shù)的建立及其與對蝦生長相關(guān)性的研究.pdf

1、蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）是近幾年新發(fā)現(xiàn)的寄生于對蝦肝胰腺組織的新病原，2009年泰國養(yǎng)殖的生長緩慢的斑節(jié)對蝦首次發(fā)現(xiàn)并命名。盡管蝦肝腸胞蟲不會引起對蝦的死亡，但它與對蝦生長緩慢有關(guān)。早期死亡綜合征或者急性肝胰腺壞死病（AHPND/EMS）引起的蝦高致死率使得人們將更多的注意力集中到AHPND/EMS上面，忽視了蝦肝腸胞蟲造成的影響，這使得蝦肝腸胞蟲的傳播越來越廣泛，有信息表明在中國、印度尼西亞

2、、馬來西亞、越南、印度和泰國中都有檢出。本文從實時熒光定量檢測方法的建立、人工感染實驗、肝腸胞蟲的寄生數(shù)量與對蝦生長相關(guān)性幾個方面進行研究。
　　根據(jù)Genbank中公布的對蝦肝腸胞蟲SSU rDNA序列設(shè)計一對特異性引物，通過對引物的特異性以及靈敏度檢測實驗表明引物具有良好的特有性和較高的靈敏度。利用pMD18-T構(gòu)建含有SSU rDNA序列的重組質(zhì)粒作為實驗標(biāo)準(zhǔn)品，對反應(yīng)體系進行多次優(yōu)化建立了肝腸胞蟲SYBR Green實時熒

3、光定量PCR檢測方法。結(jié)果顯示，構(gòu)建的方法擴增循環(huán)數(shù)與目的基因拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系，且Tm值為60℃時擴增效果最好，熔解曲線僅有一個單一的特異峰，擴增所的擴增產(chǎn)物閾值循環(huán)數(shù)(Ct)與模板起始量的對數(shù)標(biāo)的準(zhǔn)曲線為Ct=-3.369 log(Sq)+39.364，相關(guān)系數(shù)R2=0.992，擴增效率為98.5％。利用建立的熒光定量方法檢測了海南采集的31份個體生長大小不均勻的凡納濱對蝦樣品，肝腸胞蟲的陽性檢出率為67.7%，高于常規(guī)PCR檢

4、測，而且通過溶解曲線分析特異性良好，表明該方法具備較好的適用性。建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法具有特異、靈敏、快速、定量的優(yōu)點，可為肝腸胞蟲進行快速檢測以及定量研究提供參考。
　　人工感染實驗利用凡納濱對蝦幼蝦和鹵蟲進行，用冰凍和鮮活的的感染有肝腸胞蟲的凡納濱對蝦肝胰腺組織去投喂健康的凡納濱對蝦，投喂一周后的樣品套式 PCR檢測結(jié)果顯示投喂冰凍和鮮活肝胰腺組織病料都可以使健康幼蝦感染肝腸胞蟲。說明肝腸胞蟲的孢子

5、能夠抵抗較差的外界環(huán)境，低溫冰凍后仍然具有感染力，這也為生產(chǎn)上肝腸胞蟲的預(yù)防和治療帶來了麻煩。鹵蟲感染實驗樣品套式 PCR檢測結(jié)果顯示為陰性，利用實驗建立的實時熒光定量 PCR方法檢測結(jié)果顯示為陽性。說明肝腸胞蟲感染鹵蟲后并沒有在鹵蟲體內(nèi)大量繁殖，但是肝腸胞蟲可以在鹵蟲體內(nèi)寄生存活。
　　在對蝦肝腸胞蟲的流行病學(xué)調(diào)查過程中，我們采集了山東即墨、江蘇贛榆以及海南儋州三個地區(qū)生長緩慢且個體大小差異明顯的凡納濱對蝦樣品，并測量了這幾批凡

6、納濱對蝦的體長，懷疑這幾批樣品是因為感染對蝦肝腸胞蟲而導(dǎo)致其生長緩慢，并且出現(xiàn)個體大小差異的明顯癥狀，利用實時熒光定量PCR檢測方法分析了肝腸胞蟲對這幾批凡納濱對蝦樣品生長的影響。實驗同時對WSSV、IHHNV、CMNV、AHPND四種病原進行PCR檢測，檢測結(jié)果顯示這幾種病原的檢出率很低。Real-time PCR檢測肝腸胞蟲結(jié)果顯示海南儋州肝腸胞蟲檢出率為68%，江蘇贛榆和山東即墨樣品肝腸胞蟲全部為陽性。利用本方法對采集自江蘇、海南