實(shí)時(shí)熒光定量PCR在凡納濱對(duì)蝦病原VPAHPND及SHIV檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)是中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中一種重要的養(yǎng)殖品種，在我國(guó)沿海地區(qū)發(fā)展迅速，目前已實(shí)現(xiàn)工廠化和產(chǎn)業(yè)化的養(yǎng)殖模式。隨著凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大以及養(yǎng)殖模式的高密度、集約化發(fā)展，養(yǎng)殖水環(huán)境逐步惡化，各種對(duì)蝦病害頻頻發(fā)生，新的對(duì)蝦病原也不斷被發(fā)現(xiàn)。
　　AHPND是近年來(lái)的一種對(duì)蝦新發(fā)疫病，凡納濱對(duì)蝦感染AHPND后能引起較高死亡率，給我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖造成嚴(yán)重?fù)p失，是一種重要的對(duì)蝦病害。攜帶含毒力基因

2、pirAVP和pirBVP的~70kb質(zhì)粒pVA1的VPAHPND是AHPND主要病原菌。
　　本研究用2.19×105 CFU/mL VPAHPND分離株20130629002S01對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)進(jìn)行浸泡感染，于感染后2-9 d采集的對(duì)蝦肝胰腺、鰓、腸道、肌肉組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組織中的pirAVP拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，感染后凡納濱對(duì)蝦各組織均能檢測(cè)到pirAVP，其中肝胰腺在

3、感染后第4 d達(dá)到峰值8.71×104 copies/mg，而鰓、肌肉、腸道分別在第3、4和5 d達(dá)到峰值9.08×103、2.59×104和9.95×103 copies/mg。感染早期鰓組織中先出現(xiàn)VPAHPND的富集，在高死亡發(fā)生期，VPAHPND數(shù)量在肝胰腺和腸道出現(xiàn)高峰，在死亡數(shù)量逐漸下降的后期，各組織的VPAHPND均快速下降，腸道、肝胰腺和肌肉中的VPAHPND水平趨于接近。對(duì)蝦肝胰腺組織病理切片顯示，同一時(shí)間有臨床癥狀的

4、病蝦和瀕死對(duì)蝦相比，瀕死對(duì)蝦表現(xiàn)出更嚴(yán)重的AHPND病理特征，且二者的組織病理特征均隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)變得更為嚴(yán)重，但檢測(cè)到的VPAHPND數(shù)量呈下降趨勢(shì)。上述研究表明，VPAHPND感染過(guò)程中組織中的pirAVP基因數(shù)量不能代表對(duì)蝦的發(fā)病程度，發(fā)病程度及組織病理嚴(yán)重的AHPND樣品中VPAHPND的數(shù)量不一定處于高水平狀態(tài)。
　　2014年浙江臺(tái)州對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦大量死亡現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)PCR檢測(cè)已知常見(jiàn)對(duì)蝦病原均顯示

5、為陰性結(jié)果，從患病凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)分離得到一種新的對(duì)蝦病原，經(jīng)電鏡觀察和二代測(cè)序分析，確定該病原屬于虹彩病毒(Iridoviridae)，暫將其命名為蝦血細(xì)胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)。
　　本研究根據(jù)SHIV假定的ATP酶序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物和TaqMan探針對(duì)SHIV進(jìn)行定量檢測(cè)。本研究中建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)SHIV顯示較強(qiáng)的特異性，對(duì)SHIV檢測(cè)靈敏

6、度為4 copies SHIV/μL DNA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2=0.99。采用建立的TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR方法定量檢測(cè)從中國(guó)各地養(yǎng)殖場(chǎng)采集對(duì)蝦樣品DNA共205份，結(jié)果顯示總的SHIV陽(yáng)性率為19.51％，205份對(duì)蝦樣品中包括181份凡納濱對(duì)蝦樣品、18份中國(guó)名對(duì)蝦樣品以及6份羅氏沼蝦樣品；SHIV陽(yáng)性檢出率分別為16.57%，27.78%和83.33%。其中181份凡納濱對(duì)蝦樣品檢測(cè)結(jié)果為SHIV陽(yáng)性的共30份，SHIV

7、的定量結(jié)果在7.65×101-4.70×107 copies/μg DNA之間，SHIV在不同凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)含量差異明顯。
　　為了進(jìn)一步研究SHIV感染凡納濱對(duì)蝦的易感組織和器官，進(jìn)行了凡納濱對(duì)蝦的SHIV人工感染試驗(yàn)，采用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)蝦不同部位的SHIV含量，結(jié)果顯示：血淋巴、觸須、額劍、尾扇、附肢、鰓、肝胰腺、肌肉這8個(gè)組織均可以檢測(cè)到SHIV；其中血淋巴SHIV含量為1.22×109 copies/μg

8、DNA，在所用檢測(cè)的組織中含量最高；觸須、額劍、尾扇分別為2.16×108、1.34×108和1.24×108 SHIV copies/μg DNA；附肢、鰓、肝胰腺SHIV的含量和其他組織相比更低一點(diǎn)，分別在6.80×107、3.06×107和1.52×107copies/μg DNA。在所檢測(cè)的對(duì)蝦組織中，肌肉中的SHIV含量是最低的，平均在7.56×106 SHIV copies/μg DNA。SHIV在血淋巴中的含量最高，在肌肉

9、中含量最低，這種結(jié)果和人工感染的凡納濱對(duì)蝦組織中WSSV的含量結(jié)果是一致的。肌肉中SHIV的含量比血淋巴中SHIV的含量低1000倍，而WSSV在肌肉中的含量只比血淋巴中的含量低10倍，這種差異一定程度上表明血淋巴細(xì)胞是SHIV的主要靶細(xì)胞。
　　研究中建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)新發(fā)現(xiàn)的對(duì)蝦病原SHIV具有較強(qiáng)特異性和較高靈敏度(4 copies SHIV/μL DNA)，可以應(yīng)用于臨床采集對(duì)蝦樣品和人工感染對(duì)蝦樣