U87-EGFRvⅢ細胞適配子的篩選及其介導siRNA轉運的初步應用.pdf

1、惡性多形性膠質瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是最常見的惡性腦腫瘤，預后非常差:成年病人1、3或者5年的生存期的概率大約分別為＜30％、＜5％、＜3％。在20％～30％的GBM病人中存在人表皮生長因子受體(epidermal growthfactor receptor，EGFR)及其常見的Ⅲ型突變體(EGFRvⅢ)的異常表達，有研究證明其表達變化與GBM的惡化及放、化療抗性有密切關系;在其它惡性腫瘤如非小細胞

2、肺癌、大腸癌、結腸癌等中均存在不同程度的EGFR及EGFRvⅢ的高表達。因此EGFR及其突變體可以作為腫瘤治療的主要靶標。目前，EGFR單克隆抗體已經(jīng)應用于臨床治療，這種抑制劑阻斷EGFR受體，使得EGFR的酪氨酸激酶信號通路失活，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。由于抗體藥物本身的免疫原性，且EGFR在正常組織中也表達， EGFR單克隆抗體的應用出現(xiàn)了許多不良反應、長期使用易出現(xiàn)耐藥性，因此開發(fā)靶向性強、免疫原性小、分子量小、毒性小、穩(wěn)定

3、好的制劑更為重要。另有研究表明EGFRvⅢ僅在腫瘤組織中表達，可作為高特異性的治療靶標;而核酸適配子技術的發(fā)展為新的抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了可能。
　　 適配子(aptamer)是能形成特定的三維空間結構的寡核苷酸，以高親和力和高特異性與靶分子結合。與傳統(tǒng)的抗體相比，適配子有如下特征:分子量小，可在體外快速合成，易于化學修飾;穩(wěn)定性好便于長期儲存;毒性低，免疫原性小;有較快較好的組織滲透性。這些優(yōu)點使得適配子可用于疾病的診斷和治療

4、。適配子可通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化技術(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment，SELEX)在容量為1013-1015的隨機寡核苷酸文庫中篩選得到。
　　 近幾年有研究報道篩選出更復雜靶分子的適配子，如細胞膜蛋白、全細胞和細菌等。相比protein-SELEX，基于細胞的cell-SELEX技術不需要純化或者固定靶分子蛋白，且靶分子或者靶蛋白能在活性狀態(tài)

5、下維持細胞表面正常的空間結構和糖基化位點，這樣易于篩選出腫瘤細胞表面的新的靶分子或靶蛋白，對腫瘤標記物的發(fā)現(xiàn)有重要意義。
　　 本研究利用cell-SELEX技術，以穩(wěn)定過表達EGFRvⅢ的U87細胞(U87-EGFRvⅢ細胞)作為靶分子，從體外合成的含30個隨機序列的寡核苷酸文庫中篩選出與U87-EGFRvⅢ細胞高親和力、高特異性結合的適配子。利用經(jīng)典ELISA的方法和生物素-鏈親和素系統(tǒng)，建立并進行細胞酶聯(lián)反應(cellen

6、zyme-linked assay，cell-ELA)實驗來測定適配子與U87-EGFRvⅢ細胞的親和力;利用共聚焦顯微鏡檢測技術尋找能被U87-EGFRvⅢ細胞表面受體介導內吞的適配子，并用此適配子作為一種傳遞c-Met siRNA進入細胞介導基因沉默的工具。
　　 首先，建立穩(wěn)定過表達EGFRvⅢ的細胞株U87-EGFRvⅢ，同時體外構建合成兩端為固定序列、中間為30個nt的隨機序列、全長為76個nt的ssDNA文庫。以貼壁

7、培養(yǎng)過夜的U87-EGFRvⅢ細胞為靶標，經(jīng)過孵育、洗滌、分離后，通過不對稱PCR法分離單鏈ssDNA，大量擴增得到下輪篩選的亞庫。篩選過程中不斷增加篩選的強度（如增加鮭精DNA量、縮短孵育時間、增加洗滌強度等）。從第四輪篩選開始，每輪引入EGFRvⅢ蛋白表達陰性的U87細胞作為反篩細胞，以去除細胞表面相同受體或者結構的干擾，經(jīng)過14輪cell-SELEX篩選和鑒定，得到與U87-EGFRvⅢ細胞高親和力、高特異性結合的適配子。

8、　　 用生物素標記的上游引物對所篩選的亞文庫進行不對稱PCR擴增，得到生物素標記的ssDNA。cell-ELA的方法檢測篩選亞文庫對U87-EGFRvⅢ細胞和U87細胞的結合力，在細胞數(shù)目和投入的ssDNA的量相同的條件下測定吸收度，從而判斷出篩選過程中結合到U87-EGFRvⅢ細胞上的ssDNA的富集情況。
　　 將第14輪的篩選產(chǎn)物進行擴增、純化、T載體克隆、“藍-白”斑篩選并測序，得到相應適配子的序列，并用RNA STR

9、UCTURE5.2軟件預測DNA的二級結構，并將這些結構進行分類，根據(jù)序列的相似性挑選出進行后續(xù)功能研究的適配子。
　　 為了鑒定適配子的特異性和親和力，用FITC標記適配子，然后與U87-EGFRvⅢ細胞孵育結合，于熒光顯微鏡下觀察結合情況;用流式細胞技術測定各個FITC標記的適配子與U87-EGFRvⅢ細胞的親和特異性;建立基于適配子的cell-ELA檢測方法，測定相關數(shù)據(jù)，在Sigmaplot12.0軟件中通過非線性回歸分

10、析獲得適配子的解離常數(shù)。
　　 共聚焦顯微鏡定位觀察適配子與U87-EGFRvⅢ細胞的結合位點，尋找能被細胞膜受體內吞的適配子。以鏈親和素磁珠-pull down實驗尋找適配子的具體分子靶標，即鏈親和素磁珠和生物素標記的適配子孵育后，再與U87-EGFRvⅢ細胞蛋白提取物孵育。此時，與生物素標記的適配子有相互作用的蛋白被固定在磁珠-適配子復合物上，通過SDS-PAGE膠分離，在PVDF膜上用EGFR抗體來顯影，若適配子能與EGF

11、RvⅢ受體結合并發(fā)生作用，那么顯影的結果將會有EGFRvⅢ蛋白145KD條帶。驗證此種適配子能介導c-Met siRNA的傳遞從而進入細胞內來抑制c-Met基因的表達。用脂質體lipofectamine2000轉染siRNA作為對照，Western blot實驗分析c-Met蛋白表達情況。
　　 結果顯示:隨著cell-SELEX篩選輪數(shù)的增加，ssDNA亞庫與U87-EGFRvⅢ細胞結合的吸收度逐漸增加，第12輪、14輪與原庫

12、相比吸收度升高，有顯著性差異(P＜0.05)。至第14輪，ssDNA與U87-EGFRvⅢ細胞的結合達到基本飽和狀態(tài)，說明ssDNA文庫在14輪已有一定的富集程度。將14輪得到的ssDNA克隆測序，序列用RNA Structure5.2軟件分析:克隆測序結果中序列的二級結構都以莖環(huán)、發(fā)夾結構為主，其中共有10個序列出現(xiàn)兩次以上的重復。在這10個序列中隨機挑出5個序列(A41、A43、A32、A47、A15)進行FITC熒光或者生物素標記

13、后進一步分析。
　　 在熒光顯微鏡下觀察序列與U87-EGFRvⅢ、U87以及HEK293三種細胞的結合情況，在U87-EGFRvⅢ細胞中觀察到較強的綠色熒光，而其它細胞均觀察不到熒光。觀察發(fā)現(xiàn)FITC標記的適配子A41、A32的綠色熒光集中在U87-EGFRvⅢ細胞核內，與DAPI的藍色光重合。為進一步驗證這一觀察結果，用共聚焦顯微鏡觀察A43、A41、A32、A47適配子在U87-EGFRvⅢ細胞的定位，確認A41、A32的

14、熒光主要聚集在細胞核中，而其它適配子的熒光主要集中在細胞膜的表面。初步推測A41、A32適配子入核的原因可能是被細胞膜蛋白EGFRvⅢ或者其它膜受體內吞所致。Cell-ELA方法測定適配子A43、A41、A32、A47、A15的解離常數(shù)值(Kd)分別為:4.40±0.27nM，37.57±6.01nM，0.62±0.04nM，3.33±0.39nM，14.09±2.95。解離常數(shù)均在100nM范圍內，其中A32的親和力最高，其親和力接近

15、同體系測定的EGFR抗體對U87-EGFRvⅢ細胞的親和力(Kd=0.32±0.07 nM)。通過pull-down實驗及Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，與A32結合的靶標為U87-EGFRvⅢ細胞中的EGFRvⅢ蛋白。
　　 較多研究報道GBM病人中c-Met的過表達或異常表達與腫瘤的惡化和預后密切相關。腫瘤標志物c-Met是酪氨酸激酶受體，其主要的配基為肝細胞生長因子(HGF)，HGF/c-Met不僅可以影響胚胎組織的發(fā)育

16、和分化，而且可以通過細胞周期、細胞粘附性、細胞遷移侵襲及抗凋亡的改變而導致致瘤性、侵襲性增強，腫瘤血管生成加速。c-Met在復發(fā)性GBM(15/19)中的表達量明顯高于原發(fā)性GBM（7/19，p=0.020）。復發(fā)性GBM病人中可觀察到c-Met的高表達。
　　 鑒于上述發(fā)現(xiàn)，由于A32具有較高的親和力和特異性，且初步認定其與U87-EGFRvⅢ結合的位點為EGFRvⅢ受體并能進入細胞。選擇生物素標記的A32、生物素標記的c-M

17、et siRNA、鏈親和素三者連接進行細胞實驗，用脂質體轉染c-Met siRNA作為陽性對照組，分別轉染48h、72h之后收集細胞進行Westemblot實驗。結果顯示:轉染48 h后，c-Met siRNA終濃度為40 nM和80 nM時，A32非轉染組和lipofectamin2000轉染組中c-Met的蛋白表達量均未有明顯下降，而在轉染48 h后，c-Met siRNA終濃度為100 nM時，與陰性對照siRNA組相比，lipo

18、fectamin2000轉染組（不加鏈親和素）中c-Met的表達量明顯減少，有顯著性差異（0.524±0.04，p=0.08），lipofectamin2000轉染組（加鏈親和素）中c-Met的表達量明顯減少（0.631±0.08，p=0.051）;c-Met siRNA投入終濃度為100nM時，72h干擾后，A32轉染組中c-Met的表達量減少明顯，與陰性對照siRNA組比有顯著性差異（0.57±0.09，p=0.039），陽性對照組

19、lipofectamine2000（不加鏈親和素/加鏈親和素）組中c-Met表達量也顯著下降(p＜0.05)。實驗證明:適配子A32能介導c-Met siRNA的傳遞進入U87-EGFRvⅢ細胞并引起c-Met基因沉默，從而影響c-Met蛋白的表達?？赡苡捎谶m配子能在受體的內吞作用下進入細胞內并在鏈親和素的作用下與siRNA連接起來并進入胞內來發(fā)揮siRNA作用，從而介導c-Met的基因沉默。實驗數(shù)據(jù)顯示適配子、鏈親和素、siRNA三者