水蛭素載體——纖維蛋白適配子的篩選與鑒定.pdf

1、內(nèi)容：心腦血管疾病包括心臟血管和腦血管疾病，是循環(huán)系統(tǒng)功能紊亂疾病的統(tǒng)稱，其具有較高的發(fā)病率、致殘率、復(fù)發(fā)率和較高的死亡率等特點(diǎn)，是全球范圍內(nèi)的首要死亡原因，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。在中國(guó)，每年死于心腦血管疾病約有300萬(wàn)人，占死亡人口總數(shù)的51％左右。因此，心腦血管疾病的預(yù)防和治療是藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要任務(wù)。
　　心腦血管病的致病因素較多且頗為復(fù)雜，而血栓形成在其疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用，因此有效的預(yù)防和治療血栓的形成對(duì)心腦血

2、管疾病具有十分重大的意義。迄今為止，臨床上用于預(yù)防和治療血栓的抗凝藥物主要有兩類：肝素類（普通肝素、低分子肝素）和維生素K拮抗劑類（華法林），然而這些藥物存在諸多不足，比如給藥不方便、治療窗窄、起效慢、誘發(fā)血小板減少癥、易與食物藥物相互作用等。因此，研發(fā)一種安全有效、高選擇性的抗凝藥物成為防治血栓性疾病的熱點(diǎn)。
　　中藥歸經(jīng)理論歷史淵源，它的理論可以追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)》，它體現(xiàn)了藥物對(duì)機(jī)體某些臟腑或某些組織器官的選擇性作用，即藥物對(duì)

3、機(jī)體作用的歸屬部位，是藥物發(fā)揮作用的定位概念。適配子與靶物質(zhì)的特異性結(jié)合作用類似于中藥的歸經(jīng)作用，可以認(rèn)為是對(duì)中藥歸經(jīng)理論的新認(rèn)識(shí)，有助于推動(dòng)中藥的現(xiàn)代化。
　　核酸適配子是一種新型的醫(yī)學(xué)分子工具，它是利用指數(shù)級(jí)富集的配體進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)從體外人工合成的隨機(jī)寡聚核苷酸文庫(kù)中篩選而來(lái)，能與靶分子高特異性和高親和力

4、的結(jié)合，可以用于血栓靶向載藥與治療，應(yīng)用前景可觀。從活血化瘀中藥水蛭中提取的水蛭素是新一代高效特異的凝血酶抑制劑，本研究旨在通過(guò)篩選得到水蛭素載體——血栓靶向性的纖維蛋白特異性結(jié)合的核酸適配子，為心腦血管疾病的防治提供新策略。
　　目的：
　　由血栓形成導(dǎo)致心腦血管疾病的病發(fā)率逐年上升，抑制血栓的形成已成為國(guó)內(nèi)外預(yù)防心腦血管疾病的熱點(diǎn)和方向。本研究以凝血途徑為著手點(diǎn)，以纖維蛋白作為靶物質(zhì)，利用指數(shù)級(jí)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，從

5、體外人工合成的99個(gè)核苷酸的隨機(jī)寡核酸文庫(kù)中篩選出與纖維蛋白高親和力、高特異性結(jié)合的適配子——水蛭素載體，為靶向于血栓的新型水蛭素抗凝藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.設(shè)計(jì)并合成引物與核酸文庫(kù)，在體外構(gòu)建全長(zhǎng)為99 nt的單鏈寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)，文庫(kù)兩端為18 nt的固定引物序列，中間為63 nt的隨機(jī)序列。
　　2.以羧基磁珠Dynabeads M-270 Epoxy為介質(zhì)，包被纖維蛋白，并用BCA法測(cè)定纖維蛋白

6、包被效率。
　　3.利用 SELEX技術(shù)，通過(guò)磁力架分離結(jié)合與未結(jié)合的核酸分子，通過(guò)不斷增加篩選壓力（增加 tRN A量、增加洗滌次數(shù)、增加搖床頻率、縮短結(jié)合反應(yīng)時(shí)間），對(duì)核酸文庫(kù)進(jìn)行重復(fù)篩選，并在第6、9、12輪進(jìn)行反篩——以空白磁珠與核酸文庫(kù)結(jié)合，除去與纖維蛋白非特異結(jié)合的核酸分子，最終篩選出了纖維蛋白適配子；在篩選的偶數(shù)輪用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增文庫(kù)，采用熒光定量間接法計(jì)算纖維蛋白與核酸文庫(kù)的結(jié)合率，待結(jié)合率不再提高時(shí)停止篩選。<

7、br>　　4.把最后一輪篩選的適配子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化后連接T載體，進(jìn)行T/A克隆，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌，挑取單克隆菌落接種于氨芐青霉素（ampicillin，Amp）抗性的液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，送公司測(cè)序，得到適配子的序列。
　　5.用 BioEd it軟件對(duì)所測(cè)適配子序列進(jìn)行比對(duì)，分析適配子一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。用DNAMAN8.0軟件對(duì)適配子序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，分析適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

8、r>　　6.對(duì)所得適配子進(jìn)行親和力和特異性分析。用膠體金標(biāo)記適配子，采用斑點(diǎn)滲濾法鑒定篩選出的纖維蛋白適配子的特異性。人工合成生物素標(biāo)記的適配子，以堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素系統(tǒng)連接酶與核酸適配子，通過(guò)酶促底物顯色反應(yīng)測(cè)定在450nm處的吸光值。利用軟件GraphPad Prism5.0，繪制適配子結(jié)合曲線圖，并用非線性回歸分析其解離常數(shù)Kd值。
　　結(jié)果：
　　1.獲得了全長(zhǎng)為99 nt的單鏈寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)，庫(kù)容量大約為10

9、17~18。
　　2.羧基磁珠成功的包被纖維蛋白，包被效率為87.65%。
　　3.經(jīng)過(guò)篩選壓力遞增的15個(gè)循環(huán)，獲得了具有較高親和力和較高特異性的纖維蛋白適配子群。
　　4.第15輪所得適配子群經(jīng)克隆、轉(zhuǎn)化，挑取90個(gè)陽(yáng)性克隆，恒溫?fù)u床孵育12~16小時(shí)后，送Invitrogen公司測(cè)序得57條適配子序列。
　　5.利用 Bio Ed it軟件對(duì)適配子序列一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)適配子序列之間存在相似片段，此為適配子

10、保守序列，推測(cè)其為與纖維蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　6.利用DNAMAN8.0軟件對(duì)適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，發(fā)現(xiàn)適配子序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)有莖環(huán)、發(fā)夾、G-四聚體等，但多以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主，且各適配子所形成的莖環(huán)數(shù)目、大小及位置不一，自由能也不同。
　　7.用膠體金標(biāo)記適配子斑點(diǎn)滲濾法檢測(cè)所獲得適配子的特異性，結(jié)果顯示篩選出的纖維蛋白適配子具有較好的特異性。以生物素-親和素-堿性磷酸酶系統(tǒng)測(cè)定不同濃度適配子與靶蛋白的結(jié)合力，繪制結(jié)合曲線

11、，結(jié)果顯示適配子與纖維蛋白具有較高的親和力，解離常數(shù)Kd值達(dá)43.12 nmol/L。
　　結(jié)論：
　　本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建了總長(zhǎng)度為99nt的單鏈寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)，利用指數(shù)級(jí)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX），以磁珠為介質(zhì)，經(jīng)過(guò)篩選壓力遞增的15個(gè)循環(huán)，成功地獲得了纖維蛋白適配子群。經(jīng)過(guò)對(duì)適配子群克隆、測(cè)序，獲得適配子的序列結(jié)構(gòu)。膠體金標(biāo)記適配子斑點(diǎn)滲濾法測(cè)定適配子的特異性，結(jié)果顯示篩選到的適配子對(duì)纖維蛋白具有較高特異性。用