水蛭素融合蛋白的表達(dá)及其與纖維蛋白適配子的偶聯(lián).pdf

1、心腦血管疾病是人類健康的威脅之一，高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率是其最大特征，不但對(duì)人類的健康有影響，還更嚴(yán)重的降低了生活質(zhì)量。在環(huán)境和生活習(xí)慣持續(xù)改變的背景下，心腦血管疾病在我國(guó)的發(fā)病高居不下，同時(shí)呈現(xiàn)出年輕化的跡象，因此針對(duì)心腦血管疾病的預(yù)防和治療是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，同樣是藥物研發(fā)的新切入點(diǎn)。
　　血栓形成是心腦血管疾病最核心的病理過(guò)程，決定著心腦血管疾病的發(fā)展和預(yù)后，血栓形成是眾多因子共同參與的復(fù)雜過(guò)程。因此做到對(duì)血栓的有效

2、預(yù)防，就相當(dāng)于防治了心腦血管病的發(fā)生，同時(shí)改善其預(yù)后。然而用于臨床的此類藥物卻很有限，常用的有肝素和華法林，雖具有一定的臨床療效，但卻存在著起效延遲、給藥不方便、易出血、需要監(jiān)測(cè)、易與食物藥物相互作用等不足。所以努力研發(fā)一種方便、安全的抗凝藥物是很有必要的。
　　水蛭（Leech）是中藥中活血化瘀的的代表藥，具有破血、逐瘀、通經(jīng)的功效，臨床上常用于各種瘀滯不通所引起的疾病。水蛭素（hirudin, H）是水蛭的唾液腺提取物之一，是

3、很強(qiáng)的天然凝血酶抑制劑，但也存在一些不足，例如分子量小、半衰期短；功能單一；易出血等，因此本研究組對(duì)其進(jìn)行基因重組，首先在其基因中插入具有抗血小板功能的RGD序列，同時(shí)在其N端連接SA（鏈霉親和素）序列，如此增大其分子量，延長(zhǎng)其半衰期。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)pET-44b-SA-H-RGD質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，在確定質(zhì)粒序列與理論序列完全正確后， IPTG誘導(dǎo)融合蛋白并純化， SDS-PAGE和Western-blot結(jié)果表明：成功誘導(dǎo)SA-H-R

4、GD融合蛋白并純化，進(jìn)一步使用BCA法檢測(cè)純化蛋白濃度，并對(duì)SA-H-RGD的抗凝血酶和抗血小板活性進(jìn)行驗(yàn)證；另一方面對(duì)已經(jīng)篩選出來(lái)的纖維蛋白適配子G81-2進(jìn)行修飾，在其5'端連接生物素(biotin)。在SA與biotin間存在特異性結(jié)合的原理上，使得SA-H-RGD與生物素標(biāo)記的G81-2適配子可成功偶聯(lián)，如此新型、靶向、多功能的抗凝分子將推進(jìn)血栓性疾病防治的進(jìn)程，有望降低心腦血管病的發(fā)生率，改善其預(yù)后。
　　目的：由血栓引

5、起的心腦血管疾病的發(fā)病率逐年上升，在心腦血管病中占有越來(lái)越高的比例，因此防止血栓的形成是防治心腦血管疾病的關(guān)鍵所在。因此本研究選擇天然凝血酶抑制劑水蛭素為研究目標(biāo)，在確定質(zhì)粒序列與理論序列完全一致后， IPTG優(yōu)化誘導(dǎo)SA-H-RGD融合蛋白并純化，并對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)對(duì)纖維蛋白適配子G81-2進(jìn)行biotin標(biāo)記，成功將其與SA-H-RGD偶聯(lián)，為靶向于血栓的抗凝新藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.將含pET-4

6、4b-SA-H-RGD質(zhì)粒的甘油菌先加入在無(wú)抗的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，繼而加入在氨芐青霉素（ampicillin, Amp）和氯霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
　　2.使用SSCS法制備Rosetta-gami感受態(tài)細(xì)胞。
　　3.使用質(zhì)粒提取盒提取pET-44b-SA-H-RGD質(zhì)粒，進(jìn)一步測(cè)序確定SA-H-RGD序列。用BioEdit軟件對(duì)比所測(cè)SA-H-RGD序列與理論序列。
　　4.將pET-44b-SA-H-RGD質(zhì)粒

7、轉(zhuǎn)化入Rosetta-gami感受態(tài)細(xì)胞，第二天挑取單個(gè)菌落，過(guò)夜培養(yǎng)，次日，將菌液按1:50的比例接種于雙抗LB培養(yǎng)液，待OD值在0.4~0.6之間時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，設(shè)計(jì)不同的濃度梯度和時(shí)間梯度，濃度梯度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mmol/L，時(shí)間梯度分別為0、1、2、3、4、5、6h，從而選擇最佳的誘導(dǎo)條件。
　　5.超聲裂解菌液，冰上操作，超5s停10s，總時(shí)間60min。
　　6.Hi

8、s GraviTrap柱純化蛋白，在Binding buffer清洗柱子，再將超聲后的上清加入His GraviTrap柱子進(jìn)行純化，繼續(xù)加入Binding buffer，最后用Elution buffer洗脫蛋白。
　　7.SDS-PAGE電泳，先配好膠，上樣，濃縮膠電壓90V，分離膠電壓120V。完成后考馬斯藍(lán)染色，Odddesy紅外熒光掃結(jié)果。
　　8.Western-blot，先將凝膠轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染液染色，再

9、用封閉液blocking buffer封閉1h，加入一抗（anti-H）4℃過(guò)夜，第二天，繼續(xù)加入二抗放置搖床1h，完成后用Odyssey紅外熒光掃膜。
　　9.BCA法檢測(cè)純化蛋白的濃度，先計(jì)算工作液體積，再制備標(biāo)準(zhǔn)品，將待測(cè)樣品蛋白按一定濃度稀釋，最后將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品依次加入96孔板，用酶標(biāo)儀檢測(cè)。
　　10.通過(guò)檢測(cè)不同濃度SA-H-RGD加入血漿后的APTT、PT、TT值，驗(yàn)證融合蛋白的抗凝血酶活性。
　

10、　11.通過(guò)電阻法測(cè)定加入不同濃度SA-H-RGD后血小板的聚集率，驗(yàn)證融合蛋白的抗血小板活性。
　　12.對(duì)纖維蛋白適配子G81-2進(jìn)行biotin標(biāo)記，并將其與SA-H-RGD進(jìn)行偶聯(lián)，用EMSA進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)SSCS法成功獲得Rosetta-gami感受態(tài)細(xì)胞。
　　2.獲得了大量pET-44b-SA-H-RGD質(zhì)粒。
　　3.測(cè)序結(jié)果經(jīng)BioEdit軟件比對(duì)與理論序列相一致。<

11、br>　　4.反復(fù)優(yōu)化表達(dá)條件，摸索出誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度0.9mmol/L，誘導(dǎo)5h。
　　5.可溶性分析結(jié)果表明表達(dá)蛋白主要存在于上清中，提示誘導(dǎo)的SA-H-RGD為可溶性蛋白。
　　6.SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)純化的蛋白在72KD附近有蛋白條帶，Western-blot檢測(cè)蛋白能和特異的一抗結(jié)合，表明融合蛋白表達(dá)成功。
　　7.BCA法定量結(jié)果顯示，純化的融合蛋白濃度為7.8mg/mL。

12、r>　　8.在抗凝血實(shí)驗(yàn)中，加入SA-H-RGD，APTT、TT和PT值均有延長(zhǎng)，且存在量效關(guān)系，隨著SA-H-RGD濃度增大，APTT、TT和PT值延長(zhǎng)越明顯。
　　9.在抗血小板實(shí)驗(yàn)中，加入SA-H-RGD，血小板聚集明顯被抑制，且隨著SA-H-RGD濃度的增大，血小板聚集抑制越明顯，存在量效關(guān)系。
　　10.EMSA結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的蛋白與前期所篩選的纖維蛋白適配子G81-2有結(jié)合功能。
　　結(jié)論：本研究成