慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞適配子的篩選、鑒定與結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、目的:
　　 利用SELEX技術(shù)篩選、鑒定出慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的寡核苷酸適配子,測定出ssDNA文庫與K562細(xì)胞的結(jié)合率,并對克隆適配子進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)同源性分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,為白血病的基因診斷和靶向基因治療奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 體外合成長度為88個堿基的隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫,采用生物素-鏈霉親和素磁珠法制備次級文庫,以正常人血液中提取的中性粒細(xì)胞為反篩細(xì)胞,利用SELEX技術(shù)

2、篩選出與慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞特異結(jié)合的適配子。將篩選得到的適配子回收純化后連接pGEM-T質(zhì)粒載體,經(jīng)藍(lán)白篩選后,隨機(jī)挑選24個克隆子進(jìn)行序列測定。采用熒光標(biāo)記引物法檢測ssDNA文庫與K562細(xì)胞的親和力,并用DNAMAN軟件對適配子序列進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)同源性分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。
　　 結(jié)果:
　　 SELEX篩選產(chǎn)物PCR擴(kuò)增時最佳退火溫度為45℃；每輪篩選的模板含量和循環(huán)次數(shù)都各不相同；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,

3、電泳條帶隨SELEX輪數(shù)的增加逐漸變細(xì)變致密。經(jīng)過13輪篩選,慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞適配子的結(jié)合率不斷增高,適配子的吸光度A值從0.12上升到1.25,至第13輪A值無明顯增高。測序結(jié)果顯示,絕大部分適配子與預(yù)期片段長度相同,但有幾個適配子短于預(yù)期片段長度。一級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)無同源序列,但可分為6個家族(family),其中5個家族各自具有保守序列,家族6無保守序列。二級結(jié)構(gòu)分析表明:適配子形成的莖環(huán)、凸環(huán)結(jié)構(gòu)可能是與K562細(xì)胞特

4、異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。24個克隆適配子中,第10號適配子與慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的結(jié)合率最高,為45.2％,而與正常人血液中提取的中性粒細(xì)胞的結(jié)合率僅為2.8％。
　　 結(jié)論:
　　 1、利用SELEX技術(shù)從體外構(gòu)建的88 nt的ssDNA文庫中成功篩選出高親和力、高特異性的慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞適配子；
　　 2、成功測出ssDNA文庫與慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的結(jié)合率；
　　 3、成功將