重組人FcγRI核酸適配子的體外篩選及其在膿毒血癥實(shí)驗(yàn)診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的:
　　以重組人FcγRI胞外段蛋白作為靶分子，應(yīng)用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)技術(shù)，從體外合成組合化學(xué)的96 nt隨機(jī)ss DNA核酸文庫(kù)中篩選出人FcγRI高親和力和高特異性的適配子，用人FcγRI特異性核酸適配子建立初步的、應(yīng)用于膿毒血癥實(shí)驗(yàn)診斷的新方法。
　　方法:
　　1.體外化學(xué)合

2、成96 nt隨機(jī)ss DNA核酸文庫(kù)，文庫(kù)中核酸序列的兩端均為18 nt固定的引物序列，中間為60 nt的隨機(jī)序列，以重組人FcγRI蛋白片段為靶標(biāo)，應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選針對(duì)人FcγRI高親和力和特異性的核酸適配子，用熒光標(biāo)記法檢測(cè)ssDNA富集文庫(kù)與人FcγRI的結(jié)合力;
　　2.將第7、8輪篩選PCR產(chǎn)物TA克隆、測(cè)序，采用相關(guān)軟件對(duì)測(cè)序的單克隆核酸適配子進(jìn)行生物信息學(xué)分析;
　　3.挑選人FcγRI單克隆核酸適配子，

3、使用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡測(cè)定其親和力、靈敏度和特異性。
　　結(jié)果:
　　1.熒光定量分析顯示，第6輪篩選ssDNA富集庫(kù)與人FcγRI結(jié)合力達(dá)到峰值，ssDNA富集庫(kù)與該靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和狀態(tài);
　　2.結(jié)合ClustalX1.83、Mega5和RNAstructure5.6分別將第7、8輪單克隆適配子分成7和5個(gè)家族;第7輪篩選的33條核酸適配子中有三對(duì)完全一致的富集序列;RNAstructure5.6模擬的核

4、酸適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以莖-環(huán)和G-四聚體結(jié)構(gòu)為主;
　　3.流式細(xì)胞分析結(jié)合軟件計(jì)算適配子LW7-1、LW7-9與LW7-27的親和力分別為12.76 nM、14.03 nM、6.676 nM，Kd值均達(dá)到納摩爾水平，適配子檢測(cè)細(xì)胞數(shù)可低至2×106個(gè);
　　4.流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，LW7-1、LW7-9和LW7-27與膿毒血癥中性粒細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度明顯比陰性對(duì)照和正常對(duì)照強(qiáng)，說(shuō)明這三條適配子是針對(duì)中性粒細(xì)胞表面的F

5、cγRI蛋白的;
　　5.熒光顯微鏡分析顯示，三條適配子均能夠單獨(dú)或協(xié)同檢測(cè)膿毒血癥中性粒細(xì)胞，LW7-9所染細(xì)胞熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，是我們后續(xù)研究的重點(diǎn)，熒光標(biāo)記適配子直接檢測(cè)法(FLADA)也是我們建立的初步的、由熒光顯微鏡檢查的、有望實(shí)現(xiàn)膿毒血癥鑒別診斷的新方法。
　　結(jié)論:
　　本研究運(yùn)用SELEX技術(shù)經(jīng)過(guò)8輪篩選，獲取針對(duì)人重組FcγRI胞外段蛋白特異性ssDNA核酸適配子，我們對(duì)部分核酸適配子進(jìn)行了親和力、靈敏度