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文檔簡介
1、鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)為多胺合成第一個限速酶,催化鳥氨酸脫羧生成腐胺,腐胺再相繼生成精脒和精胺。腐胺、精脒和精胺統(tǒng)稱多胺。多胺的代謝與腫瘤的發(fā)生和維持腫瘤細(xì)胞惡性表型有著密切的關(guān)系,鳥氨酸脫羧酶可以通過調(diào)節(jié)多胺的含量在細(xì)胞增殖、分化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。 胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,在我國的死亡率居惡性腫瘤之首。胃癌的致病因素較多,發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。早期胃癌患者無任何
2、癥狀或癥狀缺乏特異性,因此胃癌的早期診斷較為困難,病人就診往往是晚期,死亡率較高。目前,治療胃癌首選手術(shù)及術(shù)后常規(guī)化療,手術(shù)后5年生存率只能到40%。胃癌治療的其他方法正在探索中。國外報道鳥氨酸脫羧酶水平在多種癌組織中增高。但是,鳥氨酸脫羧酶與胃癌的關(guān)系未見報道。 為了研究ODC基因作為胃癌診治靶標(biāo)的可行性,為探討以O(shè)DC為靶標(biāo)建立胃癌早期診斷和基因治療方法提供理論依據(jù)和技術(shù)對策,本文首先從組織水平研究了ODC基因表達(dá)與胃癌的關(guān)
3、系,繼而利用ODC反義RNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株SGC—7901與GES—1,從細(xì)胞水平觀察ODC基因下調(diào)抑制胃癌的作用。 實(shí)驗(yàn)方法: 第一部分、 ODC基因在胃癌組織表達(dá)水平的研究 1.半定量RT—PCR檢測標(biāo)本中ODCmRNA 分別取21例新鮮胃癌標(biāo)本及距腫瘤處7cm外的癌旁組織,所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。其中高中分化10例,低分化11例。按照Trizol試劑盒的說明提取結(jié)直腸癌組織及正常組織中的總RNA,
4、用隨機(jī)引物Oligo dT按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA第一條鏈,RT反應(yīng)產(chǎn)物用作PCR的模板DNA,使用特異性引物進(jìn)行PCR。β—actin基因作為內(nèi)參照。取10μl PCR產(chǎn)物在2%瓊脂凝膠電泳,紫外燈下觀察電泳帶,凝膠成像分析系統(tǒng)掃描拍照。分析讀取各條帶灰度,并將所獲得的目的基因與作為內(nèi)參的管家基因條帶灰度進(jìn)行比較。通過在半定量水平測定21例胃癌患者的癌旁組織和癌組織中的ODC mRNA表達(dá)的相對水平,觀察其與臨床病理
5、學(xué)指標(biāo)的關(guān)系。統(tǒng)計學(xué)處理:每個樣本重復(fù)測定3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,采用配對t檢驗(yàn)和兩個樣本的t檢驗(yàn)、使用SPSS(12.0)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。 2.Western Blot檢測標(biāo)本中ODC蛋白表達(dá)量 標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理后,剪碎,用組織裂解液RIPA制備勻漿,提取總蛋白并測定濃度,經(jīng)SDS—PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育及顯色得出結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.21例胃癌標(biāo)本中ODC
6、 mRNA表達(dá)豐度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,癌組織1.25±0.34,癌旁正常組織為0.36±0.18,胃癌組織ODC mRNA表達(dá)量較癌旁正常粘膜組織顯著升高,差異顯著(P<0.01)。低分化胃癌ODC mRNA表達(dá)量較高中分化顯著升高,差異顯著(P<0.01)。 2.Western Blot顯示腸癌組織中ODC蛋白表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織。 結(jié)論: 本文證明胃癌組織中ODC基因表達(dá)增高,并且低分化胃癌ODC的基因
7、表達(dá)量高于高中分化胃癌,表明胃癌的發(fā)生和發(fā)展與ODC的表達(dá)有關(guān)。上述研究結(jié)果提示ODC可作為胃癌基因診斷的靶分子,也初步提示ODC基因可作為胃癌基因治療的靶標(biāo)。 第二部分、抑制ODC基因的表達(dá)與胃癌細(xì)胞株生長、侵襲能力關(guān)系的研究 實(shí)驗(yàn)方法: 1.鳥氨酸脫羧酶pcDNA—ODCr反義載體瞬時轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株,Western—blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中ODC的表達(dá) pcDNA—ODCr載體帶有ODC蛋白質(zhì)編碼
8、區(qū)的反義序列,采用脂質(zhì)體包被該反義載體并瞬時轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC—7901與胃永生化細(xì)胞GES—1。同時設(shè)計空白pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對照組與空白對照組。Western—blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中ODC蛋白質(zhì)的表達(dá)量,并與空白pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染組與空白對照組進(jìn)行比較。 2.細(xì)胞活性檢測法(MTS)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株的增殖能力 用MTS法檢測反義載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、空白載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞以及空白對照組細(xì)胞的增殖活性。檢測時刻分別是
9、轉(zhuǎn)染后0h,24h,48h,72h,并繪制細(xì)胞的增殖曲線。 3.檢測轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞株的侵襲能力 用Transwell小室檢測反義載體轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,并與空白pcDNA3.1組和空白對照組進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.Western blotting結(jié)果顯示反義載體轉(zhuǎn)染后,胃癌細(xì)胞株ODC蛋白表達(dá)量明顯降低。 2.繪制細(xì)胞增殖曲線,反義載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC—7901與胃永生化細(xì)胞GES—1細(xì)
10、胞后,兩株細(xì)胞的增殖活性均較對照組明顯降低,抑制率分別為60%和57%。 3.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)鳥氨酸脫羧酶pcDNA—ODCr反義載體可以抑制胃癌細(xì)胞SGC—7901和胃永生化細(xì)胞GES—1的侵襲能力。 結(jié)論: ODC反義載體pcDNA—ODCr可以下調(diào)胃癌細(xì)胞株中的ODC表達(dá)量,轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞株增殖與侵襲能力下降,表明ODC基因下調(diào)能起到治療胃癌的作用。 總之,以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明OD
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