鳥氨酸脫羧酶G316A多態(tài)性與乳腺癌預后的關(guān)系和機制研究.pdf

1、乳腺癌是目前女性最常見的致死性惡性腫瘤之一，近年來，隨著人們生活和工作方式的改變，我國乳腺癌發(fā)病率快速上升，已經(jīng)成為嚴重影響我國女性生存和生活質(zhì)量的一個公共健康問題。鳥氨酸脫羧酶(omithine decarboxylase，ODC)是多胺合成過程中第一個也是最重要的限速酶，在許多人類惡性腫瘤組織包括乳腺癌組織中高度表達。MYC與Max形成復合物結(jié)合于E-box(CACGTG)時，即可激活ODC的表達;而當Max與MYC的拮抗蛋白MAD

2、家族成員（包括Mnt、MAD1、MXI1及MAD4等）形成復合物結(jié)合于E-box時，即可抑制ODC的表達。這提示MYC蛋白、MXI1蛋白以及ODC之間可能存在一定的關(guān)系。目前關(guān)于ODC G316A位點多態(tài)性與乳腺癌預后的關(guān)系，以及此位點在乳腺癌預后中的作用尚不清楚，同時DFMO抑制ODC的合成是否與此位點的多態(tài)性相關(guān)也知之甚少。因此，本研究通過探討ODC G316A基因多態(tài)性在乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預后中的作用，旨在為驗證此多態(tài)性位點能否成為

3、乳腺癌預后新的遺傳學標記物奠定基礎。
　　分析MXI1蛋白、C-MYC蛋白表達及ODC G316A位點與乳腺癌患者生存關(guān)系;研究MXI1蛋白、C-MYC蛋白表達與ODC G316A多態(tài)性關(guān)系，并且研究藥物DFMO對乳腺癌細胞系發(fā)揮作用與ODC G316A多態(tài)性的關(guān)系。
　　方法
　　1.MXI1蛋白、C-MYC蛋白表達及ODC G316A位點與乳腺癌患者生存關(guān)系:
　　通過免疫組化檢測乳腺癌標本中MXI1和C-M

4、YC蛋白表達，利用巢式PCR及毛細管電泳(PCR-RFLP)方法對乳腺癌標本進行ODC G316A位點的分型;采用Kaplan-Meier法對C-MYC蛋白、MXI1蛋白表達狀況和ODC G316A位點不同基因型與乳腺癌患者的生存時間進行分析;
　　2.MXI1蛋白、C-MYC蛋白表達與ODC G316A多態(tài)性關(guān)系:
　　在乳腺癌細胞系MCF-7中轉(zhuǎn)染MXI1-shRNA Plasmid重組質(zhì)粒，并篩選得到MXI1穩(wěn)定敲底的

5、細胞系MCF-7-shMXI1。通過實時定量PCR和Western blot方法分別在mRNA和蛋白水平上確認MXI1基因敲底效果。利用基于Taqman探針的RT-PCR方法檢測MXI1基因敲底后的ODC G316A等位基因的變化;采用染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)方法研究C-MYC蛋白和MXI1蛋白對ODC G316A等位基因的親和性;
　　3.DFMO對乳腺癌細胞系的作用

6、與ODC G316A多態(tài)性的關(guān)系:
　　利用MTT(噻唑蘭)比色法檢測不同濃度的DFMO對MDA-435細胞和SK-br3細胞的增殖抑制作用，流式細胞術(shù)檢測不同濃度的DFMO對兩種細胞的凋亡和周期影響。
　　結(jié)果
　　1.MXI1蛋白、C-MYC蛋白表達與乳腺癌患者生存時間的關(guān)系:
　　300例確診的乳腺癌患者中有92(30.67％)例患者MYC高表達，而208(69.33％)例患者MYC低表達（其中有65例中等

7、染色，103例低染色，40例無染色）;而對于MXI1，有71(23.67％)例患者高表達，229(76.33％)例患者低表達（其中有78例中等染色，109例低染色，42例無染色）。對于C-MYC蛋白來說，C-MYC高表達組(high expression group，C-MYC-HEG)的乳腺癌患者較C-MYC低表達組(low expression group，C-MYC-LEG)的患者具有更短的生存時間，差異具有統(tǒng)計學意義(x2=16

8、.003，P=0.000);而對于MXI1蛋白，MXI1低表達組(low expression group，MXI1-LEG)的乳腺癌患者較MXI1高表達組(high expression group，MXI1-HEG)組的患者具有更短的生存時間，差異具有統(tǒng)計學意義(x2=7.266，P=0.007)。
　　2.ODC G316A位點多態(tài)性與乳腺癌患者生存時間分析:
　　在分析時300例乳腺癌患者有168例(56％)患者去世

9、，其中ODC GG組患者72例(42.86％)，ODC AA/AG組患者96例(57.14％)。進一步的數(shù)據(jù)分析顯示，ODC GG組患者的10年生存率為53.85％，而對于ODC AA/AG組的10年生存率僅為33.33％，差異具有統(tǒng)計學意義(x2=15.812，P=0.000)。進一步對患者的分期與ODC G316A分型之間的關(guān)系亦進行了統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示:對于Ⅰ期乳腺癌患者ODC GG組和ODCAA/AG組患者生存時間無明顯差異(

10、x2=0.021，P=0.884);對于Ⅱ期乳腺癌患者ODCGG組和ODCAA/AG組患者生存時間亦無明顯差異((x2=0.423，P=0.5125)。而對于Ⅲ期乳腺癌患者，ODC GG組患者的中位生存時間為9年2個月(10年生存率為44.23％)，ODCAA/AG組患者的中位生存時間為8年5個月（10年生存率為24％），兩組間生存率差異有統(tǒng)計學意義(x2=5.464，P=0.019)。
　　3.MXI1蛋白、C-MYC蛋白表達與

11、ODC G316A多態(tài)性關(guān)系:
　　C-MYC蛋白和MXI1蛋白表達高低與ODC G316A的多態(tài)性有關(guān):C-MYC蛋白在ODC AA/AG組的高表達率明顯高于ODCGG組(x2=17.812，P=0.000);而MXI1蛋白在ODCAA/AG組的低表達率也高于ODC GG組(x2=5.524，P=0.019)。MXI1基因沉默對ODC基因和蛋白的表達無明顯影響，但是ODC G316A等位基因A/G表達量卻發(fā)生了變化，A較G的表達

12、量明顯上升。而且Western blot結(jié)果顯示，C-MYC蛋白和MXI1蛋白在乳腺癌的MDA-435細胞系和MCF-7細胞系中均有表達。染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)果顯示，C-MYC蛋白和MXI1蛋白均選擇性地結(jié)合于ODC G316A的等位基因A。
　　4.DFMO對乳腺癌細胞系的作用與ODC G316A多態(tài)性的關(guān)系:
　　DFMO對乳腺癌細胞系SK-br3(ODC AA)的增殖抑制作用強于對MDA-435(ODC GG)細胞系的作用

13、:10mmol/l及20mmol/l的DFMO對MDA-435和SK-br3作用48小時的生長抑制率分別為24.1％和33.6％、46.3％和53.5％，且OD值差異均具有統(tǒng)計學意義(t=2.134，P=0.021;t=2.213，P=0.019);10mmol/l及20mmol/l的DFMO對MDA-435和SK-br3作用72小時的生長抑制率分別為28.9％和35.7％、54.3％和65.4％，且OD值差異均具有統(tǒng)計學意義(t=2.

14、434，P=0.015;t=2.489，P=0.013);當DFMO的濃度是20mmol/l時，檢測24h、48h、72h時MDA-435(ODC GG)和SK-br3(ODC AA)細胞系的凋亡率，分別為7.58％±2.06％ VS13.88％±3.45％(t=2.047，P=0.041)、43.28％±14.28％ VS59.96％±16.42％(t=3.680,P=0.000)和77.87％±30.25％ VS93.08％±32.

15、15％(t=3.293, P=0.0001)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。流式細胞術(shù)檢測細胞周期，當DFMO的濃度是20mmol/l時，測得MDA-435(ODC GG)細胞系和SK-br3(ODC AA)細胞系在培養(yǎng)24h、48h、72h后S期細胞所占比例分別為13.25％±2.38％VS12.89％±2.21％，21.43％±3.12％VS12.24％±3.55％,16.32％±3.23％VS15.24±3.01％，對這三組

16、數(shù)據(jù)分別進行統(tǒng)計檢驗，測得48小時的S期細胞，MDA-435(ODC GG)細胞系明顯高于SK-br3(ODC AA)細胞系，差異具有統(tǒng)計學意義（t=2.638，P=0.012）。進一步檢測經(jīng)DFMO處理的乳腺癌細胞系MCF-7的ODC G316A等位基因A/G表達量，結(jié)果顯示ODC G316A等位基因A的表達量降低（t=3.708，P=0.000），而G的表達量無明顯變化。
　　結(jié)論
　　1.C-MYC蛋白的高表達和MXI

17、1蛋白的低表達可以作為乳腺癌患者預后不良因素，對于ODC G316A多態(tài)性，ODC AA/AG基因型乳腺癌患者預后比ODCGG基因型患者預后更差。ODC G316A基因多態(tài)性可望成為乳腺癌的一種新的遺傳學標記物。
　　2.MXI1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能和ODC G316A的等位基因A結(jié)合從而起到調(diào)節(jié)作用。
　　3.DFMO對不同ODC G316A遺傳學類型的乳腺癌細胞系增殖、凋亡和細胞周期的影響不同;推測此種作用的可能潛在