多胺生物合成關(guān)鍵酶—鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)抑制劑篩選及其鑒定.pdf

1、目的：鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ODC）是最重要的調(diào)控多胺生物合成的關(guān)鍵限速酶，由此成為當(dāng)前抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)新的分子靶點(diǎn)。二氟甲基鳥(niǎo)氨酸（DFMO）是ODC不可逆抑制劑，其分子結(jié)構(gòu)與鳥(niǎo)氨酸類(lèi)似，能夠競(jìng)爭(zhēng)性地與該酶的活性中心結(jié)合而抑制ODC的活性，使多胺的合成減少。在II期臨床試驗(yàn)中，DFMO由于使用劑量高和毒副作用大而限制了它在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。因此,篩選更高效且毒副作用小的新型ODC抑制劑有重要的臨床意義。本研究旨在綜合應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬高通量篩選和

2、分子、細(xì)胞水平上的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，從小分子化學(xué)庫(kù)中篩選和鑒定新的ODC酶抑制劑。
　　方法：（1）計(jì)算機(jī)模擬高通量篩選能與ODC結(jié)合的小分子化合物；（2）MTT、RTCA、細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)小分子化合物對(duì) A549細(xì)胞增殖能力的影響；（3）ODC的原核表達(dá)及純化；（4）以原核表達(dá)的ODC為基礎(chǔ)建立用于篩選ODC抑制劑的實(shí)驗(yàn)技術(shù)；（5）微量熱泳動(dòng)儀檢測(cè)篩選出的小分子化合物與ODC間的相互作用。
　　結(jié)果：（1）計(jì)算機(jī)模擬高通量篩選出90

3、個(gè)小分子化合物；（2）發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)小分子化合物能夠顯著抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)；（3）成功克隆并構(gòu)建人ODC原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)及純化出人 ODC蛋白，以此蛋白為基礎(chǔ)建立篩選 ODC抑制劑的實(shí)驗(yàn)技術(shù)；（4）發(fā)現(xiàn)小分子化合物D24在低濃度下（IC50=8.355??）能夠顯著抑制ODC酶活性；（5）發(fā)現(xiàn)D24能與ODC高親和性結(jié)合，其結(jié)合能力顯著性高于對(duì)照藥物DFMO。
　　結(jié)論：通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬高通量篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出一個(gè)能有效抑制O