苦豆子賴氨酸脫羧酶基因克隆及表達分析.pdf

1、賴氨酸脫羧酶（Lysine Decarboxylase，LDC）基因是苦豆子（Sophora alopecuroidesL.）苦參堿（Matrine，MA）和氧化苦參堿（Oxymatrine，OMA）生物合成途徑的第一個關鍵酶基因，在其生化代謝過程中起著重要的作用。本研究以西北特有中藥材苦豆子為材料，克隆其賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)和啟動子序列，分析不同苦豆子居群賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列多樣性，挖掘與OMA含量相關聯的SNP位點，探討該基

2、因表達與MA和OMA含量的關系，驗證其啟動子的功能，旨在揭示賴氨酸脫羧酶基因的功能，為通過遺傳工程等手段培育高MA和OMA含量的苦豆子奠定基礎。研究結果如下:
　　(1)采用同源克隆技術從苦豆子中分離得到長度為1368bp的DNA片段，經測序、BLAST驗證為賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列，命名為SaLDC（登錄號:KM249871）。生物信息學分析表明，苦豆子賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)與苦參（Sophora flavescens）和狗苦

3、參（Echinosophorakoreensis）賴氨酸脫羧酶基因序列一致性高達97％，該基因共編碼455個氨基酸殘基，蛋白質分子量49.14KD，屬于PLPDEⅢ超基因家族。在氨基酸序列中找到了產喹諾里西啶類生物堿(Quinolizidine Alkaloids，QAs)植物的賴氨酸脫羧酶蛋白的特征性保守位點Phe340。聚類結果顯示，苦豆子與產QAs的植物聚為一個大類。
　　(2)采用染色體步移技術，先后分別獲得約800bp和

4、1500bp的DNA片段，經測序、拼接后獲得長度為1948bp的苦豆子賴氨酸脫羧酶基因啟動子片段。生物信息學分析該基因轉錄起始位點可能位于起始密碼子上游45bp處，其核心啟動子元件TATA box和CAAT box分別位于-27bp和-81bp處。在啟動子區(qū)域存在有大量的與光響應、逆境防御應答、激素響應、組織特異性表達相關的順式作用元件，推測苦豆子賴氨酸脫羧酶在生命活動過程中較為活躍，能夠行使復雜的生物學功能。
　　(3)對16個

5、苦豆子居群賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列多樣性研究表明，該基因中間部分較為保守，變異主要存在與5'端和3'端。在16個苦豆子居群賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)中共找到35個SNP，其中同義突變13個，錯義突變22個，SNP發(fā)生頻率為1SNP/39.08bp。Tajima'D值檢測和Ka/Ks結果顯示，16個居群苦豆子賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)進化不符合中性模型，受負向選擇作用。將SNP位點與氧化苦參堿含量進行關聯分析，共找到6個有價值的突變位點，可用于

6、篩選高含量氧化苦參堿苦豆子的Caps引物開發(fā)。
　　(4)用不同質量分數PEG模擬干旱脅迫萌動苦豆子種子和幼苗，結果顯示:干旱脅迫下，子葉中MA和OMA的含量和賴氨酸脫羧酶基因表達量下降，但重度脅迫（PEG質量分數＞20％）卻使子葉中賴氨酸脫羧酶基因表達量上升，且超過對照。葉片中賴氨酸脫羧酶基因表達量和OMA含量隨PEG質量分數和脅迫時間的變化呈動態(tài)變化趨勢，重度脅迫下，賴氨酸脫羧酶基因的表達和OMA的積累均被抑制;輕度和中度干旱