瑞舒伐他汀通過抑制p38 MAPK信號途徑減輕心肌梗死大鼠的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu).pdf

1、研究背景:心房顫動(atrial fibrillation，AF)簡稱房顫，主要表現(xiàn)為心臟節(jié)律異常，其特征是快速無序的心房顫動。AF是臨床上最常見的心律失常。很多時候并無癥狀，有時候會感覺心悸、胸痛、氣短或者暈厥。AF可以增加中風(fēng)、心力衰竭和死亡的風(fēng)險，嚴(yán)重威脅人類健康。心肌梗死發(fā)生后除發(fā)生室性心律失常外，房性心律失常，尤其是AF的發(fā)生亦較常見。盡管AF很重要，我們?nèi)祟愐策M行了超過100年的基礎(chǔ)和臨床研究，我們?nèi)匀粵]有完全理解它的根本機

2、制，也沒有徹底掌握如何有效地治療它。已有研究證實，在AF發(fā)生的病理機制中，心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)和神經(jīng)重構(gòu)對AF的發(fā)生、復(fù)發(fā)和維持可能起著重要的作用，但結(jié)構(gòu)重構(gòu)很可能比神經(jīng)重構(gòu)和電重構(gòu)扮演更重要的角色。心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)包括細胞和細胞外間質(zhì)的改變，其主要表現(xiàn)是心房間質(zhì)纖維化。而間質(zhì)纖維化主要發(fā)生在細胞外基質(zhì)，后者的主要成分是膠原。
　　絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路

3、是最重要的細胞生長信號調(diào)節(jié)通路之一，主要包括3個重要的成員酶:ERK、p38、JNK。其中p38 MAPK參與一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程，如細胞增殖、細胞分化、細胞死亡、細胞遷移和侵襲。有研究顯示抑制p38 MAPK信號通路可以減少大鼠心室成纖維細胞增殖和膠原合成。另有研究表明，番茄紅素通過抑制p38MAPK的活化而改善心功能和心室重構(gòu)。磷酸化p38(P-p38) MAPK是p38 MAPK的活性狀態(tài)，是否參與心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，目前還

4、不清楚。
　　他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是目前應(yīng)用最為廣泛的調(diào)脂藥物，已成為治療高脂血癥及防治動脈粥樣硬化性疾病的基石。除了調(diào)脂作用以外他汀還有一系列有益的生物學(xué)效應(yīng)即“多效性作用”正在被廣泛認可，其中包括預(yù)防和治療AF、提高擴張型心肌病患者左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricularejection fraction，LVEF)、改善心肌梗死大鼠左室的重構(gòu)和功能等。所以，他汀類藥物可通過改善左心室功能

5、、提高LVEF、降低左心房壓力進而間接減輕左心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)。另有實驗研究表明，托拉塞米能顯著降低心力衰竭大鼠的左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)。由于在沒有瓣膜病變的情況下，LVEDP可視為左心房壓力，因此推論托拉塞米可以降低心力衰竭大鼠的左心房壓力，并有可能會進一步間接減輕左心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)。
　　我們先前對心肌梗死兔使用瑞舒伐他汀灌胃干預(yù)8周進行研究觀察，研

6、究結(jié)果顯示瑞舒伐他汀組受損的心房細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與對照組比較得到改善，提示瑞舒伐他汀可以改善心肌梗死后的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。但是他汀有可能通過改善心肌梗死后心室功能，降低心房壓力，間接改善心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)。
　　他汀類藥物是否直接減輕心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的效應(yīng)，及其機制如何，目前還不清楚。為了觀察瑞舒伐他汀對心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的直接影響，我們在前期實驗研究的基礎(chǔ)上采用托拉塞米作為陽性對照藥物，來消除瑞舒伐他汀對心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的

7、間接影響，試圖證實瑞舒伐他汀可以減輕心肌梗死后心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，并探討P-p38 MAPK在心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中和瑞舒伐他汀減輕左心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中所起的作用。
　　研究目的:觀察他汀類藥物是否直接減輕心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的效應(yīng)，分析P-p38 MAPK在心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中作用，并探討P-p38 MAPK在瑞舒伐他汀減輕左心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中所起的作用。
　　研究方法:
　　1.心肌梗死模型制作及動物分組
　　體

8、重250～300 g的雄性Wistar大鼠80只。隨機選取66只雄性Wistar大鼠麻醉后氣管插管、呼吸機輔助呼吸，通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型。假手術(shù)組14只大鼠縫線在LAD下穿過但不結(jié)扎，其余步驟同心肌梗死模型制作。
　　10只心梗大鼠在手術(shù)后24小時內(nèi)死亡。存活的56只心肌梗死大鼠隨機分為四組:對照組（C組，n=14）、瑞舒伐他汀組（R組，n=14）、小劑量托拉塞米組（T1組，n=14）和大劑量托拉塞米組（T2組

9、，n=14），每天分別給予生理鹽水、瑞舒伐他?。?0毫克/千克體重）、托拉塞米（T1:1毫克/千克體重，T2:2毫克/千克體重）灌胃處理4周。假手術(shù)組(n=14)術(shù)后全部存活，每天給予生理鹽水灌胃處理4周。在接下來的4周里，5個組中只有對照組1只大鼠死亡。
　　2.超聲心動圖檢查
　　4周干預(yù)期結(jié)束時，5組大鼠行經(jīng)胸超聲心動圖檢查。測量左心房直徑(LAD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左心

10、室短軸縮短率(LVFS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)等。
　　3.LVEDP測定
　　超聲心動圖檢查結(jié)束時，用2F壓力-容積電導(dǎo)導(dǎo)管通過右頸動脈插入到左心室，導(dǎo)管的另一端連接到16通道生理記錄儀進行血流動力學(xué)檢測。測定的LVEDP視為左心房壓力。
　　4.樣本的采集和處理
　　測定LVEDP后處死大鼠，開胸并分離左心房。取左心房分成兩部分，一部分放入10％福爾馬林固定，石蠟包埋切片（切片厚約4微米），用于Mass

11、on染色和免疫組化染色;另一部分迅速放入液氮中保存，用于Western blot分析。分離的左心室存入液氮備用。
　　5.組織學(xué)分析
　　每組大鼠的心房肌切片行Masson染色，染色后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果，藍色為膠原纖維，紅色為肌纖維。膠原容積分?jǐn)?shù)(collagenvolume fraction，CVF)是指視野中膠原染色的區(qū)域面積占總面積的百分比。每張切片上隨機選取8個視野，通過使用ImagePro Plu

12、s軟件(version6.0，USA)計算CVF來反映左心房纖維化程度。計算CVF時視野中血管周圍區(qū)域不記入內(nèi)。心室切片使用氯化三苯基四氮唑染色后計算梗死面積。
　　6.免疫組化染色
　　切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟后，用濃度0.01M、PH7.4的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液對抗原進行修復(fù)，經(jīng)0.3％ H2O2甲醇溶液對內(nèi)源性過氧化酶封閉后，用山羊血清對切片封閉30min，滴加一抗(兔抗大鼠P-p38 MAPK，1∶1600 dilu

13、tion，Cell Signaling Technology，Massachusetts，USA)，4℃過夜。沖洗后在室溫用二抗(抗兔IgG biotinylated antibody，1∶200 dilution，AK5004，Vectastain，USA)孵育30分鐘。然后用ABC復(fù)合物在室溫孵育切片30分鐘，再用3-3-二氨基聯(lián)苯胺和用作色原的0.005％的H2O2顯色1-3分鐘。接下來切片用Harris蘇木精復(fù)染色2-5分鐘，在

14、梯度乙醇和二甲苯中脫水，用封片膠(Entellan neu，Merck，Germany)封片。使用尼康I80顯微鏡觀察切片，每張切片上隨機選取8個視野計算陽性細胞指數(shù)。
　　7.Western blot分析
　　分離的左心房組織冰上勻漿、離心，然后取上清，測定蛋白質(zhì)濃度。灌膠、樣品沸水浴、電泳、轉(zhuǎn)膜，5％脫脂牛奶封閉，一抗孵育、二抗孵育，與增強化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，分析比較。
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　使用SPSS19

15、.0軟件，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　研究結(jié)果:
　　1.瑞舒伐他汀對心臟功能參數(shù)和左心室心肌梗死面積的影響
　　與假手術(shù)組比較，4個心肌梗死組（C、R、T1和T2）心臟擴大、收縮功能不全，表現(xiàn)為LAD、LVDd和LVDs增加，而LVEF和LVFS減低。瑞舒伐他汀能增加LVEF和LVFS，表現(xiàn)出了改善左室功能的心臟保護性作用。4個心肌梗死組之間的梗死面積沒有顯著差異。
　　2.血流動力學(xué)評估
　

16、　與假手術(shù)組相比，4個心肌梗死組中LVEDP均顯著升高。R、T1和T2組中LVEDP與C組相比均明顯降低。R與T1組間LVEDP無顯著差異(p=0.37)。T2組的LVEDP明顯低于R組(P＜0.05)。因此，本研究中觀察瑞舒伐他汀對心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響時將T1組作為陽性對照組。
　　3.瑞舒伐他汀對心房纖維化的影響
　　各組大鼠左心房組織經(jīng)Masson染色后心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色。Masson染色的結(jié)果表明

17、，心肌梗死后，左心房一部分肌細胞變性和凋亡導(dǎo)致心肌面積縮小，膠原合成增加致膠原面積增大，所以CVF升高，心肌間質(zhì)纖維化發(fā)生。與假手術(shù)組相比，4個心肌梗死組（C、R、T1和T2）中的CVF顯著升高。與C組相比，R、T1和T2組的CVF明顯降低。值得注意的是R組的CVF分別低于T1和T2組，并且具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.免疫組化分析顯示瑞舒伐他汀抑制P-p38 MAPK
　　陽性細胞指數(shù)是指視野中陽性細胞占總細胞數(shù)量的百分比。在

18、本研究中，P-p38 MAPK陽性細胞的細胞核被染成棕黃色。與假手術(shù)組相比，4個MI組(C、R、T1和T2)中的陽性細胞指數(shù)明顯增加。與C組相比，T1和T2組的P-p38 MAPK陽性細胞指數(shù)均顯著下降（分別降低20.4％和29.6％），而R組的P-p38 MAPK陽性細胞指數(shù)下降更為明顯(44.6％)。R和T1、T2組之間的P-p38 MAPK陽性細胞指數(shù)均有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5.Western blot結(jié)果顯示瑞舒伐他汀對P-

19、p38 MAPK具有抑制作用。
　　與假手術(shù)組相比，4個MI組（C、R、T1和T2）中P-p38 MAPK表達明顯增多。R、T1和T2組的P-p38 MAPK的表達相比C組顯著下降。R組P-p38MAPK的表達明顯低于T1組，但與T2組間比較時無顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1.瑞舒伐他?。?0毫克/千克/天）和低劑量托拉塞米（1毫克/千克/天）在通過灌胃治療心肌梗死大鼠時，其降低LVEDP的作用無明顯差異。
　　

20、2.大鼠心肌梗死后，心房CVF升高，提示發(fā)生了心房纖維化即心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu);而且主要分布于心房肌細胞細胞核的P-p38 MAPK增加，后者很可能與心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)有關(guān)。
　　3.瑞舒伐他汀可抑制心肌梗死大鼠的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，其機制可能與瑞舒伐他汀下調(diào)P-p38 MAPK有關(guān)。
　　意義:本研究為了觀察瑞舒伐他汀對心肌梗死后心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的直接影響，我們在前期實驗的基礎(chǔ)上采用托拉塞米作為陽性對照藥物，來消除瑞舒伐他汀對心肌梗死