人工肛門括約肌植入材料的改進(jìn).pdf

1、研究背景：
　　 肛門失禁嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量,其發(fā)生與多種疾病有關(guān)。外科常見于直腸癌根治性手術(shù)切除肛門后的消化道重建,手術(shù)在治療疾病的同時,給患者日后的生活帶來極大的不便。
　　 當(dāng)前對肛門失禁的治療尚無有效措施,臨床常用的治療手段主要包括自體肌肉移植重建肛門括約肌和人工肛門括約肌植入兩種。前者在一定程度上實(shí)現(xiàn)了肛門自制,但移植之自體肌肉不同于肛門括約肌,不具備排便感覺功能,無法進(jìn)行主動控制,難以有效控制排便,其進(jìn)一

2、步的改進(jìn)由于受到機(jī)體自身?xiàng)l件的限制而困難重重；而且無論是股薄肌還是其他肌肉的移植,其手術(shù)復(fù)雜,操作困難,術(shù)后并發(fā)癥多,恢復(fù)時間長,不利推廣。
　　 植入人工肛門治療肛門失禁具有更強(qiáng)的可行性,利用生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)解決研制中的關(guān)鍵問題,使人工肛門對排便的有效控制成為可能。生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的結(jié)合對突破目前人工肛門植入治療肛門失禁的困境有重要意義。
　　 傳統(tǒng)上植入人體的人工生物材料常使用硅膠,近來有國外學(xué)者開始嘗試使用聚氨酯。

3、結(jié)合最新的納米技術(shù),將理化性質(zhì)更加優(yōu)越的聚氨酯材料與納米羥基磷灰石相結(jié)合,大大提高了其生物相容性,在不引起機(jī)體炎性反應(yīng)及免疫排斥的前提下,人工肛門括約肌材料的植入操作更加簡單,并發(fā)癥少,且一旦與微系統(tǒng)技術(shù)結(jié)合后,可實(shí)現(xiàn)維持肛門壓力和自制。人工材料的研究前景廣闊,技術(shù)成熟后可以工業(yè)化生產(chǎn)并全面推廣,國外研制出的人工心臟就是很好的例子,因此人工肛門括約肌植入材料的研制具有臨床實(shí)用價值。
　　 目的：
　　 研制納米羥基磷灰石

4、膜聚氨酯復(fù)合材料,并觀察其在體外及體內(nèi)的生物相容性,以期制作出一種理化性質(zhì)優(yōu)越,生物相容性高的人工肛門括約肌材料,為智能型原位人工肛門的最終建立提供最佳材料的選擇。
　　 方法
　　 一、納米羥基磷灰石膜聚氨酯復(fù)合材料的制備
　　 將醫(yī)用聚氨酯材料剪裁為 65mm×80mm×2mm 大小,采用甲醛氣體熏箱消毒法消毒并去除表面的污物,再將材料于 15KV的電暈放電條件下放置2分鐘,再置于 10％可溶酰胺測試管中浸泡

5、,60℃處理,經(jīng)過不同階段與聚氨酯接枝聚合,70℃震蕩過夜,后干燥密封保存。
　　 將預(yù)處理過的醫(yī)用聚氨酯材料置于 37℃環(huán)境,A 溶液為 Ca solution,CaCl2/Tris-HCl,Ca10(PO4)6(OH)2,B 溶液為 P solution,Na2HPO4,Ca10(PO4)6(OH)2,交替浸泡,每次 10 秒,取出后于蒸餾水中沖洗 10 次,再浸泡于丙酮中,然后干燥,于兩溶液中交替進(jìn)行 50 回合。將制備好

6、的材料做掃描電鏡及 X 線衍射檢測。
　　 二、納米羥基磷灰石膜聚氨酯復(fù)合材料(nHA/PU)的體外組織相容性
　　 1 nHA/PU 和小鼠成纖維細(xì)胞 L929 共同培養(yǎng)的倒置顯微鏡觀察 將 nHA/PU材料剪切為 10mm×10mm×2mm 預(yù)濕置于6孔培養(yǎng)板內(nèi),將不同濃度細(xì)胞接種于材料表面培養(yǎng),觀察細(xì)胞在材料上及周圍的生長情況。
　　 2 細(xì)胞黏附率測定 將 nHA/PU 材料剪切為 5mm×5mm×2mm

7、 大小,取24塊滅菌后預(yù)濕置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)作為實(shí)驗(yàn)組,24孔為不加材料陰性對照組,24孔置入相同大小的傳統(tǒng)硅膠材料作為陽性對照。將不同濃度細(xì)胞接種后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后 1h、2h、4h,每組各吸8孔取出培養(yǎng)液,計(jì)算貼壁率。
　　 3 掃描電鏡觀察 將nHA/PU 剪切為 20mm×20mm×2mm 置于培養(yǎng)板內(nèi),將細(xì)胞接種于材料表面,另置一組加入傳統(tǒng)硅膠材料作為對照,培養(yǎng)3天后取出材料,掃描電鏡下觀察細(xì)胞在材料上生長情況。

8、
　　 4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將 nHA/PU 材料剪切為 10mm×10mm×2mm 大小,取8塊預(yù)濕置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)為實(shí)驗(yàn)組,并設(shè)8孔不加材料的陰性對照組和8孔加入相同大小傳統(tǒng)硅膠材料的為陽性對照。加入細(xì)胞后培養(yǎng)一周后,用流式細(xì)胞儀檢測處于處于 G0/G1、S、G2/M 各階段的細(xì)胞,并計(jì)算增殖指數(shù) PI。觀察該材料對細(xì)胞周期的影響。PI=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100％。
　　

9、5 CCK-8法測定細(xì)胞生長曲線 取56塊 5mm×5mm×2mm 大小的nHA/PU 材料預(yù)濕后分別置于96孔培養(yǎng)板上為 A 組,并設(shè)56孔加入傳統(tǒng)硅膠材料對照為B組,56孔nHA/PU材料+培養(yǎng)液為C組,56孔傳統(tǒng)硅膠材料+培養(yǎng)液為 D 組。加入細(xì)胞培養(yǎng),于細(xì)胞接種后第二天,每天每組各取8個孔進(jìn)行檢測,取其均值,描繪生長曲線。
　　 所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,

10、其中細(xì)胞黏附率、細(xì)胞周期采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用 LSD 法,方差不齊的采用 Tamhane's T2 法； CCK-8 增殖活度采用重復(fù)測量因素的方差分析,以P<0.05 表示有顯著性差異。
　　 三、納米羥基磷灰石膜聚氨酯復(fù)合材料的體內(nèi)組織相容性
　　 選取健康大鼠 18 只,體質(zhì)量約200g,雌雄不限。將制作好之納米羥基磷灰石膜聚氨酯復(fù)合材料切成 5mm×2mm×5mm,滅菌備用。將大鼠隨機(jī)分成聚氨酯組

11、、實(shí)驗(yàn)材料組、對照組3組,每組6只。水合氯醛麻醉后備皮,常規(guī)消毒,鋪巾,每個大鼠腹部做4個不相接觸的切口,聚氨酯組植入醫(yī)用聚氨酯,實(shí)驗(yàn)組植入納米羥基磷灰石膜復(fù)合材料,對照組切開皮膚后直接縫合,不做處理。所有動物繼續(xù)飼養(yǎng)。于第1、4、8、12周,每個時間點(diǎn)從動物腹部選擇一個切口,實(shí)驗(yàn)組切取包裹材料的周圍組織,對照組切取切口處皮下組織,觀察大體標(biāo)本,光學(xué)顯微鏡下觀察組織炎癥浸潤情況。
　　 所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件

12、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,統(tǒng)計(jì)推斷采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析,組間兩兩比較采用 LSD法,以 P<0.05 表示有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 一、納米羥基磷灰石膜聚氨酯復(fù)合材料的制備
　　 獲得表面覆蓋有納米級別羥基磷灰石的聚氨酯材料,X 線衍射測試報告及物理參數(shù)結(jié)果顯示其粒徑達(dá)到納米級別。
　　 二、納米羥基磷灰石膜聚氨酯復(fù)合材料的體外組織相容性
　　 1 倒置顯微鏡

13、觀察 可見細(xì)胞圍繞在 nHA/PU 材料邊緣生長,且隨時間遞增,鏡下細(xì)胞數(shù)目逐漸增加。
　　 2 細(xì)胞粘附率 細(xì)胞在對照組、實(shí)驗(yàn)組和傳統(tǒng)材料組中的1h 粘附率分別為58.6％、45.4％和35.8％,三組之間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但在接種后2h和4h的細(xì)胞粘附率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3 掃描電鏡 掃描電鏡下可見,L929 細(xì)胞在傳統(tǒng)材料和nHA/PU 表面均可生長,前者的細(xì)胞呈梭形,有少量偽

14、足伸出,細(xì)胞間略有相連；而后者細(xì)胞呈“海星狀”生長,表面多突起,且通過突起與周圍細(xì)胞相連,大量偽足粘附于材料上,并可見大量微絨毛,顯示細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　 4 流式細(xì)胞儀檢測 結(jié)果顯示對照組、實(shí)驗(yàn)組和傳統(tǒng)材料組細(xì)胞皆為正常的二倍體細(xì)胞,未見異倍體細(xì)胞形成,無論傳統(tǒng)材料還是 nHA/PU 復(fù)合材料,對小鼠成纖維細(xì)胞的生長周期均影響不大。
　　 5 CCK-8 法檢測 nHA/PU 材料上細(xì)胞增殖情況 從細(xì)胞活度 OD 值所

15、繪制的生長曲線上看,細(xì)胞接種后,nHA/PU 材料組和傳統(tǒng)材料組隨時間延長均能保持一定程度的分裂增殖速度,各組不同時間水平有顯著性差異(P=0.000),吸光度值隨時間的延長而增加；同一時間點(diǎn)兩組之間有顯著性差異(P=0.014),實(shí)驗(yàn)組高于傳統(tǒng)材料組；而時間與各組之間交互效應(yīng)不明顯,均呈“S”形遞增(P=0.882)。
　　 三、納米羥基磷灰石膜聚氨酯復(fù)合材料的體內(nèi)組織相容性
　　 術(shù)后大體觀察可見各組均有一定的炎性反

16、應(yīng),但隨著時間的推移逐漸好轉(zhuǎn),至12周時已基本消失。炎性細(xì)胞及毛細(xì)血管計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:各組在不同時間點(diǎn)材料周圍組織中淋巴細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和毛細(xì)血管數(shù)均有所不同,其中對照組最少,聚氨酯組最多；手術(shù)后同一組在不同時間點(diǎn)之間也有顯著性差異,對照組在第一周達(dá)到峰值后逐漸下降,而聚氨酯組和復(fù)合材料組在術(shù)后第4周達(dá)到高峰后逐漸下降,到第12周降為最低。
　　 結(jié)論
　　 1、將組織相容性高的納米級別羥基磷灰石與作為人工肛門括約肌植

17、入材料的醫(yī)用聚氨酯結(jié)合,制作新型材料的方法可行。
　　 2、納米羥基磷灰石膜復(fù)合材料在體外與小鼠成纖維細(xì)胞 L929 有較好的組織相容性,未發(fā)現(xiàn)明顯排斥反應(yīng)及毒性反應(yīng)。
　　 3、納米羥基磷灰石膜復(fù)合材料在大鼠體內(nèi)具有良好的組織相容性,植入后未引起排斥反應(yīng),且與周圍組織結(jié)合良好。
　　 肛門失禁是各種因?yàn)橐鸬母亻T自制功能紊亂,是多因素參與引起的一種臨床癥狀,本病治療困難在于肛門功能重建,而人工肛門括約肌植入是治