(AABB)型-α螺旋短肽的從頭設(shè)計(jì)及其抗菌抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái),細(xì)菌及腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)藥物的抗性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重,人們亟待尋找一些作用機(jī)制不同而且高效低毒的新型藥物?？咕氖且活?lèi)存在于幾乎所有生物體內(nèi)的先天免疫效應(yīng)分子,呈現(xiàn)廣譜的抗菌抗腫瘤活性,具有很好的藥物開(kāi)發(fā)潛能。其中具有兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽分子,在自然界中分布尤為廣泛,由于這類(lèi)抗菌肽分子長(zhǎng)度較短,易于人工合成,所以常被作為多肽結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究的模式分子。
　　 本研究依據(jù)天然抗菌肽序列特征以及α-螺旋折疊理論,人工設(shè)計(jì)了一系

2、列具有不同抗菌抗腫瘤活性的兩親螺旋短肽分子(長(zhǎng)度≤18AA)。這些多肽中除G(IIKK)I-NH2和G(VVKK)3V-NH2外,其它多肽與天然螺旋抗菌肽類(lèi)似,在進(jìn)入疏水環(huán)境或接觸負(fù)電性磷脂囊泡后,均可以發(fā)生二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變形成兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)。我們還通過(guò)修改氨基酸序列考察了不同結(jié)構(gòu)因素對(duì)螺旋多肽生物活性的影響。通過(guò)活性檢測(cè)選取選擇性最好的肽序列G(IIKK)3I-NH2來(lái)進(jìn)一步研究它的抗菌抗腫瘤機(jī)制。論文還利用共培養(yǎng)體系證實(shí)了該多肽對(duì)細(xì)

3、菌和腫瘤細(xì)胞的選擇性。以上這些研究可以為今后更好的人工設(shè)計(jì)活性螺旋短肽分子提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論參考。逐漸增加G(IIKK)nI-NH2分子中序列單元的重復(fù)次數(shù)n(1-4),多肽抗菌抗腫瘤活性以及對(duì)正常細(xì)胞的毒性都會(huì)隨之增強(qiáng)。其中只有G(IIKK)31-NH2具有高效低毒的特點(diǎn)。通過(guò)分析得出n≤3時(shí),增加多肽重復(fù)單元的數(shù)目,可以保證多肽對(duì)正常細(xì)胞低毒的同時(shí)明顯提高多肽的抗菌抗腫瘤活性,當(dāng)n>3后,對(duì)多肽抗菌抗腫瘤活性的影響變小,但對(duì)正常細(xì)胞

4、的毒性會(huì)隨n的增加顯著的增強(qiáng)。
　　 本文通過(guò)研究多肽兩親螺旋結(jié)構(gòu)中親/疏水面分離程度以及親/疏水面交叉位置不同對(duì)多肽活性的影響發(fā)現(xiàn),親/疏水面完全分離的多肽分子對(duì)正常細(xì)胞的毒性明顯增大,在疏水面插入一個(gè)Lys分子后可明顯降低多肽對(duì)正常細(xì)胞的毒性而不影響多肽分子的抗菌抗腫瘤活性。我們還發(fā)現(xiàn)親水氨基酸在疏水面的插入位置不同對(duì)多肽的活性影響并不明顯。除此實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)當(dāng)疏水面具有連續(xù)4個(gè)疏水氨基酸時(shí),就可以滿足螺旋多肽與磷脂膜疏水核

5、心之間所需的疏水作用力。改變疏水氨基酸側(cè)鏈構(gòu)型后,抗菌肽對(duì)正常細(xì)胞的毒性明顯改變。Leu、Nle與Ile相比,前兩種氨基酸的疏水性以及形成螺旋的能力都有所增強(qiáng)。保持多肽長(zhǎng)度以及陽(yáng)離子性不變時(shí),多肽疏水性的增加對(duì)多肽與中性磷脂膜作用的影響要大于對(duì)多肽與負(fù)電磷脂膜作用的影響?？s短疏水氨基酸側(cè)鏈長(zhǎng)度后,分子疏水性明顯降低,多肽的各項(xiàng)生物活性都明顯降低,這也說(shuō)明多肽疏水面保證一定的疏水性對(duì)多肽的活性也是必須的。通過(guò)考察親水面氨基酸側(cè)鏈長(zhǎng)度對(duì)多肽

6、活性的影響發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi)縮短親水氨基酸的側(cè)鏈長(zhǎng)度,可以明顯提高多肽抗菌抗腫瘤活性以及對(duì)正常細(xì)胞的毒性,當(dāng)縮短到一定程度后(一個(gè)-CH2-),多肽在低濃度時(shí)的活性降低,高濃度時(shí)活性增加,這可能是親水氨基酸側(cè)鏈太短時(shí),會(huì)對(duì)疏水面與磷脂膜疏水核心的相互作用產(chǎn)生影響。研究中我們還發(fā)現(xiàn),多肽分子的溶血活性與多肽分子的表面活性存在明顯的正相關(guān)特性。這可能是由于螺旋多肽向紅細(xì)胞膜表面吸附時(shí),不存在足夠的靜電作用,所以表面活性強(qiáng)的螺旋多肽向中性磷脂

7、膜表面吸附的能力越強(qiáng),導(dǎo)致溶血毒性增強(qiáng)。比較所有的多肽分子,只有G(IIKK)3I-NH2分子具有高效抗菌抗腫瘤活性時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的毒性較低,即該多肽具有很高的選擇性。我們利用體外共培養(yǎng)體系也證實(shí)了這種選擇性的存在。同時(shí)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)所有多肽分子對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用要強(qiáng)于革蘭氏陰性菌,這種對(duì)細(xì)菌種類(lèi)的選擇性與不同細(xì)菌在細(xì)胞膜組成的差異有關(guān)。通過(guò)對(duì)多肽G(IIKK)3I-NH2的抗菌抗腫瘤機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),該多肽也可以像多數(shù)天然抗菌肽一樣破