GSK-3β介導了內質網(wǎng)應激誘導的tau蛋白過度磷酸化及大鼠空間記憶障礙.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開：
　　 第一部分
　　 內質網(wǎng)應激通過激活GSK-3 β誘導tau蛋白過度磷酸化及大鼠空間記憶障礙阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病。以細胞內的神經(jīng)纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）和細胞外的老年斑（senile plaques,SPs）形成為主要兩大病理特征。Tau蛋白是一種微管相關蛋白，具有促進微管蛋白聚

2、合成微管和維持其功能穩(wěn)定的作用。但當tau蛋白發(fā)生過度磷酸化時，將失去其對微管的穩(wěn)定作用，導致神經(jīng)退行性變。自從發(fā)現(xiàn)過度磷酸化的tau蛋白是組成AD 神經(jīng)原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）的主要成分后，tau蛋白的研究即成為了熱點。但對于AD中導致tau蛋白過度磷酸化的上游因素一直尚不清楚。內質網(wǎng)是蛋白質合成、折疊，維持鈣穩(wěn)態(tài)的重要場所。細胞內環(huán)境發(fā)生改變，未折疊/錯誤折疊蛋白發(fā)生聚集時，將誘導內質網(wǎng)

3、應激。大量研究表明內質網(wǎng)應激與AD的病理改變密切相關，在AD 病人腦內發(fā)現(xiàn)，其海馬神經(jīng)元內內質網(wǎng)陪伴分子Bip(Bip/GRP78)和內質網(wǎng)膜的跨膜蛋白PERK、eIF2 α和IRE1 α的磷酸化水平明顯增高。且內質網(wǎng)應激可激活AD-樣tau蛋白異常磷酸化的關鍵性激酶GSK-3 β。由此提示內質網(wǎng)應激、tau 異常磷酸化和GSK-3 β之間存在重要聯(lián)系。
　　 目的：為了探討內質網(wǎng)應激在AD 發(fā)病中的作用及其機制，在大鼠體內以及

4、細胞水平進行了研究，旨在闡明內質網(wǎng)應激對tau蛋白磷酸化和大鼠空間記憶的影響及其機制。
　　 方法：在動物水平采用腦立體定位技術，給予大鼠（左）側腦室注射內質網(wǎng)應激誘導劑tunicamycin(衣霉素，TM）或thapsigargin(毒胡蘿卜素，TG)，以及聯(lián)合注射GSK-3 β特異性抑制劑SB216763。分別進行Morris 水迷宮、免疫印跡、酶活性測定和免疫沉淀實驗，來檢測內質網(wǎng)應激對大鼠空間記憶能力以及tau蛋白磷酸化

5、水平的影響及其機制。細胞水平，用thapsigargin 處理HEK293/tau 細胞，以及同時聯(lián)合給予不同濃度的SB216763 或轉染dnGSK-3 β(dominant-negative GSK-3 β)質粒，利用免疫印跡技術檢測tau蛋白的磷酸化水平及其機制。
　　 結果：在本實驗中我們觀察到以下結果。⑴ Tunicamycin/thapsigargin 誘導內質網(wǎng)應激。⑵ 內質網(wǎng)應激導致大鼠空間記憶障礙、tau蛋白的

6、過度磷酸化以及GSK-3 β的激活。⑶ 抑制GSK-3 β，可以改善內質網(wǎng)應激所誘導的大鼠空間記憶障礙及tau蛋白的過度磷酸化。⑷ 內質網(wǎng)應激通過Akt，F(xiàn)yn和 PTP1B 介導的途徑，激活GSK-3 β。⑸ 內質網(wǎng)應激發(fā)生時，靜息狀態(tài)下與內質網(wǎng)跨膜蛋白PERK、IRE-1、ATF-6 結合的內質網(wǎng)陪伴分子Bip 游離下來，通過與GSK-3 β、tau蛋白的結合，導致tau蛋白的過度磷酸化。
　　 由此我們得出以下結論：內質網(wǎng)

7、應激通過Akt、Fyn和PTP1B 途徑激活GSK-3 β，從而誘導tau蛋白過度磷酸化及其大鼠空間記憶障礙。
　　 第二部分
　　 LiCl 通過抑制GSK-3 β改善thapsigargin 誘導的tau蛋白過度磷酸化微管相關蛋白tau的異常過度磷酸化參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，特別是阿爾茨海默?。ˋlzheimer's Disease，AD）。內質網(wǎng)應激存在于多種神經(jīng)退行性疾病中，且可激活導致tau蛋白過度磷

8、酸化的關鍵激酶GSK-3 β。
　　 目的：探討內質網(wǎng)應激對tau蛋白磷酸化水平的影響及其相關機制。
　　 方法：在動物水平，給予大鼠腹腔注射氯化鋰（270mg/kg）兩天，于第二天腹腔注射氯化鋰后兩小時，采用腦立體定位技術，給予大鼠（左）側腦室注射thapsigargin（毒胡蘿卜素）。在細胞水平，給予HEK293/tau 細胞和SH-SY5Y 細胞thapsigargin 處理，以及同時給予不同濃度氯化鋰共孵育。利用

9、蔗糖梯度離心及細胞體外孵育方法，分別將從HEK293/wt 細胞中提取的內質網(wǎng)（應激狀態(tài)下（thapsigargin 處理）和非應激狀態(tài)下（等量DMSO 處理）的內質網(wǎng)），與HEK293/tau 細胞的胞漿進行體外孵育，利用免疫印跡技術對tau蛋白磷酸化水平及GSK-3 β活性檢測。
　　 結果：在本實驗中我們觀察到以下結果。⑴ 在動物和細胞水平，thapsigargin 通過降低GSK-3 βSer-9位點的磷酸化水平，增加G