高爾基體破碎誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化的機(jī)制及golgin-84的保護(hù)作用.pdf

1、背景：高爾基體是細(xì)胞內(nèi)承擔(dān)分泌蛋白及膜蛋白的修飾、分選、包裝運(yùn)輸?shù)闹匾?xì)胞器。不同的生理或病理狀態(tài)下，高爾基體形態(tài)呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)，其中最典型的形態(tài)改變是高爾基體破碎，如細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞凋亡過程中的高爾基體破碎。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：神經(jīng)退行性疾病發(fā)病過程中，如阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD），神經(jīng)元高爾基體發(fā)生破碎。神經(jīng)元高爾基體破碎的生理或病理意義，引起了廣泛關(guān)注。AD是一種老化相關(guān)性神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性認(rèn)知障

2、礙為臨床表現(xiàn)，患者腦內(nèi)的兩個(gè)病理學(xué)特征是老年斑和神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成，后者的主要成分是過度磷酸化的tau蛋白。AD tau蛋白在包括Thr205、Thr231、Ser262、Ser396及Ser404在內(nèi)的超過30個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了過度磷酸化，其機(jī)制尚不清楚。AD腦組織的病理學(xué)研究提示，神經(jīng)元高爾基體破碎發(fā)生于tau蛋白過度磷酸化之前，但高爾基體破碎是否為tau蛋白過度磷酸化的上游事件有待研究。
　　目的：觀察神經(jīng)元高爾基體在老

3、化過程中的形態(tài)變化，并探討高爾基體破碎對tau蛋白磷酸化水平的影響極其可能機(jī)制。
　　方法：采用透射電子顯微鏡觀察4-、8-、13-、16月齡C57BL/6小鼠皮層及海馬神經(jīng)元高爾基體的形態(tài)改變，并進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)、計(jì)算高爾基體破碎的比例；使用免疫印跡方法同時(shí)檢測相應(yīng)腦區(qū)高爾基體基質(zhì)蛋白及tau蛋白磷酸化水平的改變；在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人類最長tau異構(gòu)體cDNA的人胚腎細(xì)胞（HEK293/tau cell）中，通過給予高爾基體破碎誘導(dǎo)劑，布雷

4、菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)及5μM諾考達(dá)唑(nocodazole)，及RNA干擾技術(shù)誘導(dǎo)高爾基體破碎，觀察高爾基體破碎情況和tau蛋白磷酸化水平的改變；采用RNA干擾、過表達(dá)技術(shù)及給予特異性激酶抑制劑等，研究相關(guān)機(jī)制并進(jìn)一步證實(shí)golgin-84的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：通過透射電子顯微鏡觀察并分類計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)在13及16月齡C57BL/6小鼠的海馬中神經(jīng)元中，高爾基體破碎的比例分別為22.6％及22.4％，顯著高于

5、4及8月齡C57BL/6小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)高爾基體破碎的比例（分別為4％及7.2％）；同時(shí)采用免疫印跡技術(shù)檢測到13及16月齡C57BL/6小鼠的腦內(nèi)tau蛋白磷酸化水平顯著增高。進(jìn)一步使用高爾基體干擾劑，5μM BFA及5μM諾考達(dá)唑，于不同時(shí)間點(diǎn)處理HEK293/tau細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)顯著的高爾基體破碎，繼而tau蛋白Thr205、Thr231、Ser262、Ser396、Ser422及Ser214位點(diǎn)磷酸化水平顯著增高。高爾基體基質(zhì)蛋

6、白是維持其正常形態(tài)的重要因素，我們在10及14月齡C57BL/5小鼠的海馬中檢測到高爾基體基質(zhì)蛋白 Golgin-84和高爾基重組堆疊蛋白65(GRASP65)表達(dá)水平明顯降低。在HEK293/tau細(xì)胞中，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)這兩種基質(zhì)蛋白時(shí)，僅觀察到golgin-84缺失，而非GRASP65，能引起高爾基體破碎及tau蛋白磷酸化水平增高；進(jìn)一步過表達(dá)外源性golgin-84則能逆轉(zhuǎn)BFA誘導(dǎo)產(chǎn)生的高爾基體破碎及 tau蛋白過度磷酸

7、化。最后,我們還證明細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激5(cyclin-dependent kinase5，Cdk-5)及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)在golgin-84水平下調(diào)后激活，同時(shí)，抑制這兩種激酶的活性則能逆轉(zhuǎn)golgin-84下調(diào)所引起的tau蛋白過度磷酸化。
　　結(jié)論：隨年齡增長，神經(jīng)元高爾基體破碎的比例增加；高爾基體破碎能誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化；高