異常A2AR信號促進(jìn)TBI后多腦區(qū)磷酸化tau蛋白增多及空間記憶障礙的機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)以其高死亡率及嚴(yán)重的后遺效應(yīng)受到社會的廣泛關(guān)注。認(rèn)知功能障礙是TBI慢性期嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的并發(fā)癥，空間記憶障礙是認(rèn)知功能損傷后的重要表現(xiàn)。TBI患者腦內(nèi)可檢出過度磷酸化tau蛋白及其聚合或纏結(jié)產(chǎn)物，這些產(chǎn)物統(tǒng)稱為tau蛋白病變，它是以認(rèn)知障礙為主要特征的阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的典型病理改變之一。因此，包括慢性創(chuàng)傷性腦病在內(nèi)的TBI

2、后情感、認(rèn)知功能障礙類疾病及其他含有tau蛋白病變的神經(jīng)退行性疾病被統(tǒng)稱為tau蛋白病。近年對AD的研究發(fā)現(xiàn)tau蛋白病變可在腦內(nèi)復(fù)制及傳播，可能是病情進(jìn)展的重要機(jī)制。而TBI所致空間記憶障礙患者腦內(nèi)tau蛋白病變的出現(xiàn)早于AD等其他神經(jīng)退行性疾病，腦區(qū)分布規(guī)律也具有自己的特點。這些是否是導(dǎo)致TBI后認(rèn)知障礙早期出現(xiàn)的原因目前仍不明確。
　　TBI后大量產(chǎn)生的腺苷可以激活腺苷A2A受體(Adenosine A2A Receptor

3、, A2AR)，研究結(jié)果表明拮抗A2AR可以降低AD患者腦內(nèi)tau蛋白磷酸化水平、減少淀粉樣斑塊的堆積，并顯著改善認(rèn)知功能、情感障礙等神經(jīng)功能異常。另外，近年研究發(fā)現(xiàn)的“類淋巴”系統(tǒng)在星形膠質(zhì)細(xì)胞水流的介導(dǎo)下參與清除細(xì)胞外代謝廢物。水通道蛋白4(AQP4)在血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足的極性分布是類淋巴系統(tǒng)中介導(dǎo)物質(zhì)清除的星形膠質(zhì)細(xì)胞水流定向流動的關(guān)鍵，受星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及磷酸化修飾調(diào)控。而A2AR的激活與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及cAMP/PK

4、A等信號通路關(guān)系密切。因此我們希望通過本課題的研究探索A2AR促進(jìn)TBI后多個腦區(qū)p-tau產(chǎn)生增多及清除障礙的機(jī)制及與空間記憶功能障礙的關(guān)系。
　　本研究中，我們使用可控皮質(zhì)打擊方法(controlled cortical impact，CCI)建立中度TBI模型。應(yīng)用免疫組織化學(xué)、western blot等方法檢測TBI后24 h、7d及4w小鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化水平升高的時間、空間及細(xì)胞分布規(guī)律。進(jìn)而在A2AR基因敲除小鼠

5、及藥理學(xué)干預(yù)等條件下在動物整體水平檢測TBI后A2AR活化引起的神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白磷酸化水平升高及相關(guān)軸突、樹突損傷情況;通過行為學(xué)實驗檢測空間記憶（空間參考記憶及空間工作記憶）功能障礙;免疫熒光方法觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)A2AR表達(dá)升高與特定腦區(qū)的類淋巴系統(tǒng)關(guān)鍵分子AQP4的極性分布受損及胞外tau蛋白清除障礙的關(guān)系;最后，通過過表達(dá)人P301S位點突變tau蛋白及腦區(qū)特異性激活A(yù)2AR，探討A2AR對p-tau由海馬向前額葉皮質(zhì)傳播的促

6、進(jìn)作用，并通過western blot及免疫共沉淀手段分析其分子機(jī)制。
　　主要實驗結(jié)果及結(jié)論:
　　1.在中度創(chuàng)傷性腦損傷后24 h、7d及4w時間點檢測tau蛋白在Thr205、Ser262、Ser404等位點的磷酸化水平。通過與神經(jīng)元標(biāo)志物Neun共染，確定磷酸化tau蛋白的細(xì)胞定位。結(jié)果表明，TBI后tau蛋白磷酸化水平升高，主要位點為Ser404。傷后24 h在傷側(cè)皮層、海馬、丘腦及對側(cè)皮層、海馬、丘腦即出現(xiàn)tau

7、蛋白Ser404位點磷酸化水平升高。傷后7d，磷酸化tau蛋白水平在傷側(cè)皮層、丘腦及對側(cè)皮層、海馬仍繼續(xù)升高。此外，前額葉皮質(zhì)也開始出現(xiàn)磷酸化tau蛋白的堆積。傷后4w，磷酸化tau蛋白主要位于傷側(cè)丘腦及對側(cè)海馬、前額葉皮質(zhì)。過度磷酸化tau蛋白主要位于神經(jīng)元內(nèi)。淀粉樣肽前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)及高爾基染色的結(jié)果表明，TBI后tau蛋白磷酸化水平升高與神經(jīng)元軸突、樹突損傷關(guān)系密切。行為學(xué)結(jié)果

8、顯示TBI后空間記憶功能受損，其中空間參考記憶傷后7d損傷顯著，傷后4w恢復(fù)至與sham組無顯著差異;空間工作記憶功能傷后7d及4w均低于sham組。以上結(jié)果提示TBI后tau蛋白Ser404位點磷酸化水平立即升高并持續(xù)至傷后4w，p-tau升高的腦區(qū)包括傷側(cè)及對側(cè)頂葉皮質(zhì)、海馬、前額葉皮質(zhì)、丘腦等空間記憶環(huán)路中的多個關(guān)鍵腦區(qū)，p-tau堆積區(qū)存在神經(jīng)元損傷樹突與軸突損傷，空間記憶功能障礙的出現(xiàn)時間與p-tau升高及神經(jīng)元損傷相符。以上

9、現(xiàn)象可能是導(dǎo)致TBI后慢性期空間記憶功能障礙迅速出現(xiàn)的重要原因。
　　2.在動物整體及細(xì)胞水平，通過藥理學(xué)（A2AR特異性拮抗劑ZM241385、非特異性拮抗劑咖啡因）及基因敲除手段探討A2AR調(diào)控TBI后tau蛋白磷酸化水平的分子機(jī)制以及抑制A2AR對空間記憶的保護(hù)作用。結(jié)果表明A2AR調(diào)控神經(jīng)元內(nèi)p-tau水平的機(jī)制包括:(1)通過激活PKA進(jìn)而易化GSK-3β對tau蛋白Ser404位點的磷酸化作用;(2)敲除A2AR可以直

10、接導(dǎo)致GSK-3β抑制性磷酸化位點Ser9磷酸化水平的升高，降低tau蛋白磷酸化水平。高爾基染色結(jié)果表明TBI后4 w對側(cè)海馬齒狀回樹突棘密度減少，與學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系密切的細(xì)長形及蘑菇形樹突棘密度降低，失能的短粗形樹突棘比例升高，抑制A2AR可以顯著改善以上神經(jīng)元樹突損傷。A2AR基因敲除可以改善TBI后小鼠空間參考記憶及空間工作記憶損傷。慢性口服咖啡因可以得到更好的保護(hù)空間工作記憶的效果。因此，以上結(jié)果表明TBI可通過促進(jìn)神經(jīng)環(huán)路相關(guān)

11、腦區(qū)A2AR的活化導(dǎo)致tau蛋白磷酸化水平升高，這也可能為tau蛋白病變傳播提供了必需的“種子”。
　　3.研究表明類淋巴系統(tǒng)對細(xì)胞外液溶質(zhì)的清除需要依賴AQP4在血管周圍的極性分布介導(dǎo)的腦脊液及間隙液“集流”，AQP4的極性分布與反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生關(guān)系密切。我們通過檢測A2AR的表達(dá)水平、及GFAP與AQP4共染，發(fā)現(xiàn)TBI后對側(cè)海馬A2AR表達(dá)持續(xù)升高至傷后4w，其中3d達(dá)到高峰。傷后7d，升高的A2AR位于神經(jīng)元及星形膠

12、質(zhì)細(xì)胞中。傷后4w，神經(jīng)元內(nèi)A2AR水平降低，星形膠質(zhì)細(xì)胞中A2AR表達(dá)水平仍較高。TBI引起對側(cè)海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生顯著，AQP4失去血管周圍的極性分布而移動到胞體及粗大的星形膠質(zhì)細(xì)胞突起內(nèi)。磷酸化tau蛋白水平也隨之升高。并伴隨出現(xiàn)對側(cè)海馬CA1區(qū)放射層及多形層樹突棘密度減少，短粗形樹突棘比例增高，蘑菇形及瘦長形樹突棘比例降低。敲除A2AR可以顯著改善TBI后慢性期反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、AQP4極性紊亂、磷酸化tau蛋白堆

13、積及樹突棘形態(tài)異常等神經(jīng)病理改變。以上結(jié)果表明TBI后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)A2AR水平升高與特定腦區(qū)AQP4極性紊亂、細(xì)胞外p-tau清除障及神經(jīng)元損傷有關(guān)。
　　4.通過在非腦損傷小鼠海馬過表達(dá)人P301S突變tau蛋白，或在輕度TBI模型中傷后7d開始連續(xù)7天在損傷對側(cè)海馬齒狀回注射A2AR激動劑CGS21680，檢測海馬及前額葉皮質(zhì)內(nèi)tau蛋白磷酸化水平改變。結(jié)果顯示海馬過表達(dá)P301Stau蛋白可引起注射區(qū)周圍神經(jīng)元及同側(cè)、對側(cè)

14、前額葉皮質(zhì)等海馬神經(jīng)纖維投射區(qū)神經(jīng)元胞體內(nèi)p-tau(Ser404)含量升高。輕度TBI模型中，注射CGS21680激活A(yù)2AR可以引起注射位置tau蛋白磷酸化水平顯著升高，同時在兩側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)也可以觀察到磷酸化水平升高的tau蛋白，并顯著高于假手術(shù)組及TBI+vehicle組。以上結(jié)果表明p-tau沿神經(jīng)投射跨腦區(qū)傳播可能是TBI后p-tau出現(xiàn)在未直接受損的PFC區(qū)的原因。通過免疫熒光方法檢測調(diào)控微管解聚的關(guān)鍵分子——驅(qū)動蛋白重鏈

15、2A(kinesin heavy chainmember2A，KIF2A)發(fā)現(xiàn)TBI后傷側(cè)半球KIF2A顯著升高，傷后7d對側(cè)海馬也檢測到KIF2A含量升高。進(jìn)而通過免疫共沉淀檢測轉(zhuǎn)位因子相關(guān)蛋白(translin-associatedprotein X，TRAX)及KIF2A與A2AR的蛋白質(zhì)相互作用，發(fā)現(xiàn)TBI后A2AR對p-tau跨腦區(qū)傳播的促進(jìn)作用可能通過TRAX-KIF2A信號實現(xiàn)。
　　綜上，我們的研究表明TBI一方面

16、通過激活對側(cè)海馬A2AR信號通過PKA/GSK-3β途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白磷酸化水平升高，產(chǎn)生了tau蛋白傳播的“種子”;另一方面也可能通過TRAX/KIF2A這一非經(jīng)典途徑促進(jìn)過度磷酸化tau蛋白由對側(cè)海馬傳播至對側(cè)前額葉皮質(zhì)，導(dǎo)致TBI后多個腦區(qū)p-tau含量升高，進(jìn)而導(dǎo)致空間記憶功能障礙的早期出現(xiàn)。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞的A2AR可能通過引起AQP4分布極性紊亂，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞水流介導(dǎo)的物質(zhì)清除功能障礙，胞外tau蛋白的堆積，成為