母體血漿游離DNA分子濃度及片段完整性的分析.pdf

1、背景
　　 當(dāng)今，隨著社會(huì)的發(fā)展和醫(yī)療水平的突飛猛進(jìn)，傳統(tǒng)的感染性疾病或傳染性疾病已得到廣泛的控制和消滅，取而代之，出生缺陷卻逐漸成為嬰兒死亡的主要原因。中國(guó)是全球新生兒出生缺陷的高發(fā)國(guó)家，每一個(gè)出生缺陷的嬰兒對(duì)家庭和社會(huì)都造成了極大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，并嚴(yán)重影響嬰兒日后的生活質(zhì)量。我國(guó)已將“控制人口數(shù)量，提高人口素質(zhì)”作為基本國(guó)策，而控制出生缺陷則是提高人口質(zhì)量的根本舉措。
　　 產(chǎn)前檢查是控制出生缺陷的重要途徑。產(chǎn)前檢

2、查根據(jù)取材方法的不同分為有創(chuàng)和無創(chuàng)兩類。傳統(tǒng)的產(chǎn)前檢查技術(shù)包括羊膜腔穿刺、絨毛取樣以及臍帶取血等，這些有創(chuàng)操作對(duì)孕婦和胎兒都可能造成潛在的危險(xiǎn)，如流產(chǎn)、感染等，且易受多種因素干擾，影響其檢測(cè)指標(biāo)的準(zhǔn)確性。因此臨床上亟需一種安全、可靠、簡(jiǎn)便的無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查(noninvasive prenatal diagnosis，NPD)技術(shù)。Lo等于1997年在經(jīng)B超確定懷男性胎兒的孕婦血漿中檢查出Y染色體特異性序列，在懷孕后7周便可檢測(cè)到，且胎兒

3、DNA濃度隨著孕周的增加而增加，由此為無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查提供的新的思路，取得了本質(zhì)的突破。迄今，胎兒游離DNA已成功用于檢測(cè)胎兒染色體非整倍體、RhD基因分型、β地中海貧血等出生缺陷性疾病。盡管如此，由于強(qiáng)大的母源性背景的存在影響了這些檢測(cè)的靈敏性和特異性，使得胎兒基因位點(diǎn)的相關(guān)檢測(cè)很難實(shí)現(xiàn)，如點(diǎn)突變、胎兒非整倍體檢測(cè)等。基于此，本文探索孕婦血漿中母體和胎兒游離DNA(cell-free fetalDNA，cf-fDNA)分子之間是否存在物

4、理差異，包括片段濃度和完整性差異，以便為胎兒游離DNA的富集和標(biāo)志物的選擇提供一定依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)選擇位于人類7號(hào)染色體的leptin基因和Y染色體的SRY基因的不同分子片段進(jìn)行研究。Leptin基因在人體所有細(xì)胞中都有表達(dá)，代表孕婦血漿中母體和胎兒總游離DNA的分子片段分布；而SRY基因只在男性胎兒中表達(dá)，代表母體血漿中胎兒游離DNA分子片段分布。其中，leptin基因和SRY基因的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為80bp、202bp和83bp、206bp

5、。
　　 目的：
　　 研究母體血漿游離DNA(包括母體和胎兒)的分子生物學(xué)特性的差異，包括片段完整性和濃度的差異，為胎兒游離DNA的富集方法提供理論依據(jù)，也為開展各種出生缺陷性疾病的預(yù)警奠定了重要的工作基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.以正常男性DNA為模板，通過溫度梯度PCR和SYBR Green熒光定量PCR(quantitative fluorescence-PCR，QF-PCR)技術(shù)確定lepti

6、n基因和SRY基因的最佳引物對(duì)。并且以三名健康男性的白細(xì)胞(white blood cell，WBC)DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
　　 2.隨機(jī)選取42例門診妊娠16-20周的孕婦為研究組，同一時(shí)間隨機(jī)選取在體檢中心進(jìn)行體檢的未孕女性40例也納入實(shí)驗(yàn)。建立800ul母體血漿DNA的標(biāo)準(zhǔn)抽提方法，并用于提取孕婦和未孕女性的血漿DNA，并按照之前摸索的最佳條件進(jìn)行熒光定量PCR。
　　 3.計(jì)算妊娠組胎兒DNA SRY

7、基因以及妊娠組和對(duì)照組leptin基因的DNA濃度定量結(jié)果。并利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析比較妊娠組和對(duì)照組靶基因DNA分子片段和濃度的完整性差異，數(shù)據(jù)間比較用秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney test)。
　　 結(jié)果：
　　 1.妊娠組和對(duì)照組的leptin-80bp片段長(zhǎng)度的DNA濃度平均值分別為681(279-1680)copies/ml、429(123-923)copies/ml，中位數(shù)為608 copie

8、s/ml、383 copies/ml，p=0.001<0.01；在202bp片段長(zhǎng)度的DNA濃度平均值分別為157(38-826)copies/ml、91(29-182)copies/ml，中位數(shù)為134 copies/ml、85 copies/ml，p=0.001<0.01，可見均有顯著性差異。妊娠組leptin基因202bp和80bp片段的DNA濃度的平均值分別為157copies/ml和681 copies/ml，p=0.000<

9、0.01，也表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而妊娠組和對(duì)照組的相對(duì)濃度分?jǐn)?shù)平均值均為24%，中位數(shù)分別為21%和22%，結(jié)果表明無顯著性差異。
　　 2.妊娠組胎兒DNA SRY基因在83bp和206bp的DNA濃度平均值分別為94(38-369)copies/ml和80(71-88)copies/ml，中位數(shù)分別為77 copies/ml和79 copies/ml。分別將其與妊娠組leptin基因的80bp和202bp相應(yīng)片段比較，結(jié)果顯示

10、，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為SRY-83bp和leptin-80bp的p=0.000<0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為SRY-206bp和leptin-202bp的p=0.059>0.01，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。23例男性胎兒中，SRY基因83bp擴(kuò)增陽(yáng)性例數(shù)為20例，檢出率為87%，SRY基因206bp的陽(yáng)性例數(shù)為9例，檢出率為39%，明顯低于擴(kuò)增片段83bp的檢出率。
　　 結(jié)論：
　　 1.妊娠女性血漿的游離DNA分子濃度顯著高

11、于非妊娠健康女性的游離DNA分子的相應(yīng)濃度，妊娠母體血漿游離總DNA片段大小主要集中于100bp左右，如果要研發(fā)基于妊娠母體游離DNA的無創(chuàng)性產(chǎn)前分子診斷技術(shù)，需要將PCR擴(kuò)增片段控制在100bp以內(nèi)，才能得到更為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，有效地避免大片段擴(kuò)增可能導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。
　　 2.妊娠組女性leptin基因和SRY基因比較，leptin基因的兩個(gè)擴(kuò)增片段DNA分子的濃度都明顯高于SRY基因相應(yīng)片段的DNA濃度，表明妊娠后母體血