溫脈通對(duì)血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響.pdf

1、動(dòng)脈硬化閉塞癥(Arteriosclerosisobliterans,ASO)是常見的周圍大、中動(dòng)脈慢性閉塞性疾病之一，尤其好發(fā)生于下肢大、中型動(dòng)脈，是全身性動(dòng)脈粥樣硬化(Arteriosclerosis，AS)在肢體的局部表現(xiàn)。屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“脈痹”和“脫疽”的范疇。本病發(fā)病原因至今尚不清楚，病情復(fù)雜，并發(fā)癥多，截肢率和致死率較高，是周圍血管難治性疾病，嚴(yán)重危害人類身體健康和生活質(zhì)量。 溫脈通是臨床治療早期ASO的有效方劑，由

2、桂枝、黃芪、當(dāng)歸、川芎等組成，具有溫陽益氣、活血通脈的作用。臨床研究表明該方具有抑制血小板黏附、聚集、抗體外血栓形成，降低纖維蛋白原，改善微循環(huán)和動(dòng)脈壁彈性的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該方對(duì)家兔實(shí)驗(yàn)損傷性ASO有顯著療效，可改善血液流變學(xué)指標(biāo)，修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，降低血漿ET濃度、提高NO濃度，調(diào)節(jié)TXB2/6-Keto-PGF1α平衡。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，溫脈通可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ASO的發(fā)生、發(fā)展是多種因素相互作用的結(jié)果

3、，其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是ASO發(fā)病得啟動(dòng)因素，單核細(xì)胞與血管壁黏附并穿越血管內(nèi)皮到動(dòng)脈內(nèi)膜是ASO發(fā)病的關(guān)鍵步驟。本研究應(yīng)用多種檢測(cè)手段和方法從細(xì)胞分子水平觀察溫脈通對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及對(duì)單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附的影響，并探討其作用機(jī)制，以闡明該方防治ASO的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，為該方臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并通過溫脈通全方與溫經(jīng)益氣拆方和活血通脈拆方的比較，證明其立法組方的科學(xué)性、合理性。 本研究以體外培養(yǎng)的人臍靜脈

4、內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和THP-1細(xì)胞分別作為血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞，應(yīng)用血清藥理學(xué)方法進(jìn)行研究，采用高脂血清處理細(xì)胞作為細(xì)胞模型。分為正常對(duì)照組(5％正常兔血清)、高脂血清組(5％正常兔血清+2％高脂血清)、溫脈通全方大劑量組(5％全方大劑量藥物血清+2％高脂血清)、溫脈通全方中劑量組(5％全方中劑量藥物血清+2％高脂血清)、溫脈通全方小劑量組(5％全方小劑量藥物血清+2％高脂血清)、溫經(jīng)益氣拆方組(5％溫經(jīng)益氣拆方藥物血清+2％高脂

5、血清)、活血通脈拆方組(5％活血通脈拆方藥物血清+2％高脂血清)。實(shí)驗(yàn)分兩部分：第一部分：溫脈通對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究1.采用高脂血清處理HUVEC造成損傷，通過形態(tài)學(xué)觀察、MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性、檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH釋放等三方面，觀察溫脈通對(duì)HUVEC損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，高脂血清處理組細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞邊界不清，部分細(xì)胞脫落；溫脈通全方和拆方組細(xì)胞間隙變窄，形態(tài)趨于正常，脫落細(xì)胞減少。高脂血清組細(xì)胞活性顯

6、著下降，溫脈通全方可使細(xì)胞活性升高，并有劑量依賴趨勢(shì)；溫陽益氣拆方組、活血通脈拆方組亦可提高細(xì)胞活性，但效果遜于全方。高脂血清組細(xì)胞釋放大量LDH，溫脈通全方及拆方組使高脂血清處理的細(xì)胞LDH釋放減少，全方作用比拆方強(qiáng)。以上結(jié)果表明，溫脈通對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，全方作用優(yōu)于拆方。 2.分別采用硝酸還原酶法和放射免疫法測(cè)定HUVEC培養(yǎng)上清液中NO、ET含量。結(jié)果顯示，高脂血清可使細(xì)胞分泌的NO減少，ET升高，與正常對(duì)照組比較

7、有顯著性差異。溫脈通可使高脂作用的細(xì)胞NO分泌增加，ET分泌降低。溫經(jīng)益氣拆方和活血通脈拆方也可使NO分泌增加，其中溫經(jīng)益氣組作用與全方比無差別，活血通脈組作用比全方弱。拆方組ET水平比高脂組降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示溫脈通能提高NO水平，降低ET水平，具有保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用。 第二部分：溫脈通對(duì)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及黏附分子表達(dá)的影響1.以藥物血清預(yù)處理HUVEC或THP-1，采用蛋白染料染色法觀察THP-1與HUV

8、EC的黏附。結(jié)果顯示，HUVEC經(jīng)高脂血清作用后其與THP-1黏附量增高，而溫脈通全方及拆方均可降低這種黏附。拆方作用小于全方，但活血通脈組與全方比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。THP-1經(jīng)高脂血清及含藥血清作用后，與HUVEC的黏附量均未見改變。 2.應(yīng)用細(xì)胞ELISA法，觀察HUVEC表面黏附分子ICAM-1、VCAM-1、P-selectin表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，高脂血清處理HUVEC后，細(xì)胞表面ICAM-1、VCAM-1、P-selec

9、tin的表達(dá)均顯著增高，溫脈通全方可抑制高脂誘導(dǎo)的這三種細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，溫經(jīng)益氣拆方組可減少ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)增加，活血通脈拆方組可減少ICAM-1的表達(dá)增加，但作用均不及全方。說明溫脈通具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的作用。 本研究結(jié)果提示：1.溫脈通對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用，并能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞活性物質(zhì)的分泌，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，對(duì)ASO發(fā)病的啟動(dòng)因素有干預(yù)作用。 2.溫脈通可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞表