卵圓細(xì)胞在轉(zhuǎn)化和分化過(guò)程中的生物學(xué)特征及其分子調(diào)控機(jī)制的初步探討.pdf

1、卵圓細(xì)胞最初是1944年由Opie在大鼠誘發(fā)肝癌的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的。1956年Farber首次將其命名為卵圓細(xì)胞。體內(nèi)外研究證實(shí)，卵圓細(xì)胞即是存在于肝內(nèi)的干細(xì)胞，可以向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞甚至胰腺及腸型上皮細(xì)胞分化。 眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在人類慢性肝病、肝硬化的標(biāo)本中存在卵圓細(xì)胞，其增生的數(shù)量與該類疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，由此推論卵圓細(xì)胞參與肝臟的修復(fù)、再生過(guò)程。一般情況下，肝損傷的修復(fù)由肝細(xì)胞的再生完成，但當(dāng)肝臟損傷嚴(yán)重而持久，且成熟肝

2、細(xì)胞的再生能力被抑制時(shí)，卵圓細(xì)胞便會(huì)大量增殖，替代肝細(xì)胞修復(fù)肝組織。與此同時(shí)，卵圓細(xì)胞與肝癌發(fā)生的關(guān)系也受到了廣泛的關(guān)注。大量研究結(jié)果支持卵圓細(xì)胞參與肝臟腫瘤發(fā)生的假說(shuō)，認(rèn)為卵圓細(xì)胞可能是肝癌發(fā)生的始動(dòng)細(xì)胞。 運(yùn)用干細(xì)胞移植和/或干細(xì)胞工程生產(chǎn)肝細(xì)胞來(lái)治療各種肝病是我們研究利用干細(xì)胞的最終目的。然而當(dāng)干細(xì)胞輸入體內(nèi)后，其在體內(nèi)的分化過(guò)程難以控制，當(dāng)其大量增生而不再向成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞定向分化時(shí)，就可能形成肝細(xì)胞性或膽管細(xì)胞性肝

3、癌。而在其它相關(guān)方面的研究進(jìn)展也提供了一些有意義的啟示，如癌基因myc的失活可以使肝癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)，分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，甲胎蛋白表達(dá)消失，細(xì)胞角蛋白8和癌胚抗原表達(dá)增加，有些細(xì)胞還表達(dá)肝干細(xì)胞的標(biāo)志物[5]。這提示肝干細(xì)胞(卵圓細(xì)胞)、肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞間存在著復(fù)雜的內(nèi)在聯(lián)系，如何調(diào)控其分化成為問(wèn)題的關(guān)鍵，也是國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。 然而，經(jīng)過(guò)數(shù)十年的探討，關(guān)于卵圓細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)化調(diào)控的機(jī)制現(xiàn)今仍不十分清楚。其在何種條件下向正常

4、方向分化?何種條件下發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化?其分子機(jī)制等均未闡明。 針對(duì)以上研究現(xiàn)狀，我們?cè)噲D尋找一條途徑，能夠連續(xù)、動(dòng)態(tài)地觀察卵圓細(xì)胞不同分化狀態(tài)下的生物學(xué)特征，并借助高通量、簡(jiǎn)便快捷的分子遺傳學(xué)分析技術(shù)，全面深入地探求調(diào)控卵圓細(xì)胞分化方向的關(guān)鍵因子，明確干細(xì)胞分化為成熟肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的分水嶺。這一研究不僅具有重要的理論意義——有助于我們深入了解肝臟以及肝臟腫瘤的發(fā)生機(jī)制，也具有巨大的應(yīng)用價(jià)值——今后將卵圓細(xì)胞安全地應(yīng)用于臨床干細(xì)胞治

5、療。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模涸噲D通過(guò)建立動(dòng)態(tài)的觀察體系，探求卵圓細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)分化過(guò)程中的演變規(guī)律、生物學(xué)特征，分析相關(guān)的分子機(jī)制，以期對(duì)肝臟的發(fā)生學(xué)和肝癌的癌變機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法：復(fù)蘇肝臟卵圓細(xì)胞OC3第18代(P18)，在分別加入細(xì)胞因子EGF(A組)和HGF+EGF(B組)的培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，運(yùn)用常規(guī)細(xì)胞生物性狀檢測(cè)指標(biāo)以及免疫細(xì)胞化學(xué)、半定量RT-PCR等技術(shù)，觀察OC3在不同條件下的分化狀態(tài)，并運(yùn)用蛋白

6、芯片技術(shù)分析該過(guò)程中蛋白表達(dá)譜的改變。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論：為了鑒定所復(fù)蘇的細(xì)胞的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)前期對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)等指標(biāo)的檢測(cè)。其結(jié)果表明，這種細(xì)胞為卵圓形核，體積小(約為10um)，胞漿少。電子顯微鏡顯示為原始未分化細(xì)胞之超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；OV-6、C-kit等干細(xì)胞標(biāo)志陽(yáng)性，表明這種細(xì)胞是建株之卵圓細(xì)胞。 1、細(xì)胞在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的作用下維持生長(zhǎng)培養(yǎng)至66代，在一般形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及生物學(xué)性狀等方

7、面，均發(fā)生了明顯變化，已經(jīng)符合轉(zhuǎn)化細(xì)胞條件。這表明，化學(xué)致癌劑誘發(fā)增生的卵圓細(xì)胞，在體外培養(yǎng)能維持生長(zhǎng)數(shù)十代，獲得永生化性質(zhì)并可以自發(fā)轉(zhuǎn)化。 2、在肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)與表皮生長(zhǎng)(EGF)的共同作用下，能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞方向分化：不僅逐漸表達(dá)一些成熟肝細(xì)胞的特征(如表達(dá)白蛋白，CK18)，并且具有類似功能(如可合成糖原等)。 3、卵圓細(xì)胞具有向膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞雙向分化的潛能，并有可能是肝癌發(fā)生的