骨代謝過程中corin的表達(dá)及其生物學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs)的成骨及成軟骨分化研究
　　 目的：建立并完善入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定方法，探討其體外成骨及成軟骨分化能力。
　　 方法：
　　 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的培養(yǎng)：自愿者知情同意，按標(biāo)準(zhǔn)骨髓穿刺程序，從髂后上棘處抽取骨髓5-10mL，肝素抗凝，加于Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上，離心，以1x106個細(xì)胞接種于含基礎(chǔ)培養(yǎng)基(lO％FBS低糖DMEM，100U

2、/mL青霉素，100U/mL鏈霉素）的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后首次換液，以后每隔3d換液。
　　 2．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的鑒定：取培養(yǎng)至3代(P3)的細(xì)胞，抗體標(biāo)記后，流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面抗原的表型(CD44、CD73、CD90)；
　　 3．BMSCs的成骨分化誘導(dǎo)及鑒定：取培養(yǎng)至第3代細(xì)胞，以3x105/孔接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為4組：對照組、成骨誘導(dǎo)1,2,3周組。對照組用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，成骨

3、誘導(dǎo)組用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基，0.1μmol/L地塞米松,50mg/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-磷酸甘油鈉，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素）分別培養(yǎng)1,2,3周。進(jìn)行堿性磷酸酶活性測定、Gorimo、茜素紅、Vonkossa染色鑒定，并RT-PCR檢測成骨細(xì)胞特異基因I型膠原、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、骨唾液酸蛋白(BSA)、骨橋蛋白(OPN)及骨連接蛋白（ONN）基因的

4、表達(dá)。
　　 4.BMSCs的成軟骨分化誘導(dǎo)與鑒定：取培養(yǎng)至第3代細(xì)胞，以3x105/孔接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為4組：對照組、成軟骨誘導(dǎo)1,2,3周組。對照組用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，成軟骨誘導(dǎo)組用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1mmol/L丙酮酸鈉0.1mmol/L抗壞血酸，0.1umol/L地塞米松，1%ITS，10ng/LTGF-β1）分別培養(yǎng)1,2,3周。進(jìn)行阿爾新藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組化鑒定，并RT-PCR檢測成軟骨細(xì)胞特異性基因Coll

5、ageⅡ、CollageX、COMP及aggrecan的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．相差顯微鏡觀察：原代BMSCs培養(yǎng)72h后換液，即可觀察到貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)短小，呈長梭形、紡錘形。培養(yǎng)至7d，細(xì)胞明顯增多、變長、變大，長梭形、紡錘形形態(tài)更加明顯。14d時，細(xì)胞基本鋪滿皿底，細(xì)胞排列呈螺旋狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)中，細(xì)胞基本保持長梭形的形態(tài)。
　　 2.流式細(xì)胞儀(FCM)檢測發(fā)現(xiàn)BMSCs陽性表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表

6、面標(biāo)志CD44、CD73、CD90，陽性率均90%以上。造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45表達(dá)陰性。
　　 3．BMSCs成骨誘導(dǎo)鑒定：成骨誘導(dǎo)后，Gomori、茜素紅、VonKossa染色均為陽性，BMSCs中ALP少量表達(dá)，成骨誘導(dǎo)3d、6d、2w、3w、4w時ALP活性顯著增強(qiáng)，并隨著誘導(dǎo)時間的增長，ALP活性亦隨之增加。RT-PCR顯示誘導(dǎo)的BMSCs有CollagenI、ALP、OCN、BSP、OPN、ONN基因的表

7、達(dá)。
　　 4．BMSCs成軟骨誘導(dǎo)鑒定：成軟骨誘導(dǎo)后，阿爾新藍(lán)染色陽性，BMSCs誘導(dǎo)四周后的微球免疫組化顯示有Ⅱ型膠原的表達(dá)。RT-PCR顯示誘導(dǎo)的BMSCs有成軟骨細(xì)胞特異性基因CollageⅡ、CollageX、COMP及aggrecan的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1．建立了一整套穩(wěn)定、成熟的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增方案，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞陽性率高，傳代不喪失遺傳穩(wěn)定性，為以后的BMSCs臨床應(yīng)用

8、提供了可靠的參考依據(jù)。
　　 2．BMSCs具有很好的成骨及成軟骨分化特性，可用于自體移植，無免疫排斥反應(yīng)，可成為組織工程較為理想的種子細(xì)胞。
　　 第二部分、Corin在骨代謝過程中的表達(dá)及其生物學(xué)機(jī)制研究
　　 Corin是心臟中發(fā)現(xiàn)的一種Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，可將心鈉素前體(pro-atrialnatriureticpeptide，pro-ANP)轉(zhuǎn)化成有活性的ANP，從而調(diào)節(jié)血壓和心臟功能。最近有研究報道

9、，corin在發(fā)育著的骨組織中也有表達(dá)，骨代謝是骨形成（成骨細(xì)胞）和骨吸收(破骨細(xì)胞）不斷重復(fù)進(jìn)行的過程，骨質(zhì)疏松癥是骨代謝疾病中最常見的形式，骨質(zhì)疏松癥的形成主要是因?yàn)楣俏粘^了骨形成，進(jìn)而引起骨量的減少。那么研究骨質(zhì)疏松癥患者血清中可溶性corin及骨代謝過程中corin的表達(dá)，有助于進(jìn)一步了解corin的結(jié)構(gòu)和功能以及參與骨代謝過程的生理病理意義。
　　 目的：
　　 體外模擬體內(nèi)骨形成的過程，探討corin在骨

10、形成過程中的表達(dá)情況，檢測骨質(zhì)疏松病人血清中可溶性corin水平，探討corin的表達(dá)與骨質(zhì)疏松的關(guān)系及其臨床意義，進(jìn)而探討corin在骨代謝過程(成骨發(fā)生及破骨吸收）中的表達(dá)及其生物學(xué)作用。
　　 方法：
　　 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的培養(yǎng)及成骨及成軟骨分化，及分化過程中mRNA的提取。
　　 2．利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)對BMSCs,成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞corinmRNA的表達(dá)進(jìn)行分析

11、；
　　 3．實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)檢測BMSCs、成骨誘導(dǎo)(1,2,3周）、成軟骨誘導(dǎo)(1,2,3周）corinmRNA的表達(dá)；
　　 4．采集正常人、單純骨折病人、骨量減少及骨質(zhì)疏松癥病人的外周血于2小時內(nèi)3，000g離心10min，取上層血清，分裝保存。
　　 5．應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測125例正常人、102例單純骨折病人

12、、53例骨量減少病人、101例骨質(zhì)疏松癥病人血清標(biāo)本的可溶性corin。
　　 結(jié)果：
　　 1．CorinmRNA在BMSCs、成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)。
　　 2．隨著BMSCs成骨及成軟骨誘導(dǎo)時間的逐漸增加，corinmRNA的表達(dá)量也呈逐漸增加的趨勢。
　　 3．骨量減少與骨質(zhì)疏松癥病人血清中的corin水平明顯低于正常對照組與單純骨折組（510±228and478±183pg/mLvs.6

13、95±248pg/mLand706±345pg/mL，P＜O.001），而骨量減少與骨質(zhì)疏松癥病人組相比、正常對照組與單純骨折組相比均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；
　　 4．在骨質(zhì)疏松癥病人組，無論男性與女性患者血清corin水平均顯著低于正常男性與女性(男性組894±257vs.643±198pg/mL，P＜0.05;女性組595±172vs.438±155pg/mL,P＜O.001)；
　　 5．在骨量減少與骨質(zhì)疏

14、松癥組，我們發(fā)現(xiàn)血清corin值與病人骨密度值存在線性相關(guān)關(guān)系(P=0.03）。
　　 6．多元線性回歸分析結(jié)果提示病人病史高血壓病，(P＜0.05）是一個相關(guān)因素。另外，性別也是血清corin水平的獨(dú)立相關(guān)因素(P＜0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1．Corin在BMSCs、成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)，且在骨及軟骨形成的過程中corin的表達(dá)是上調(diào)的。
　　 2．與正常人比較，骨質(zhì)疏松癥病人血清