Dp71在胃癌中的表達(dá)及其生物學(xué)意義研究.pdf

1、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白Dystrophin是導(dǎo)致杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)的致病基因，該基因在不同的組織中和不同的組織特異性啟動(dòng)子結(jié)合，可以產(chǎn)生不同的剪切本。Dystrophin Dp71是其表達(dá)最廣泛的一個(gè)剪切本。通過和其他一些蛋白形成蛋白復(fù)合物，Dp71在各個(gè)不同的組織起著支撐和信號(hào)傳遞的作用。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Dp71介導(dǎo)的細(xì)胞的分化、增殖、黏附。改變Dp71的表達(dá)可以引起PC12細(xì)胞的細(xì)

2、胞周期發(fā)生改變。作為一種可以參與細(xì)胞分裂周期的蛋白，本課題檢測(cè)Dp71 mRNA和蛋白在胃癌組織和癌旁組織，正常人胃上皮細(xì)胞(GES-1)和胃癌細(xì)胞系(AGS，SGC-7901和BGC-823)中的表達(dá)，分析其表達(dá)差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;消減Dp71蛋白在正常胃粘膜細(xì)胞GES-1中的表達(dá)，提高Dp71在胃癌細(xì)胞系SGC-7901中的表達(dá)，并檢測(cè)細(xì)胞的活力與增殖能力，初步探討Dp71在胃癌中表達(dá)改變的生物學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)方法:(1

3、)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，western blotting、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Dp71在胃癌組織及癌旁組織，人胃粘膜上皮細(xì)胞及三種胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。
　　(2) PCR、酶切及連接反應(yīng)構(gòu)建Dp71的RNA干擾質(zhì)粒，酶切、測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建是否成功，western blotting檢測(cè)構(gòu)建的RNA干擾質(zhì)粒對(duì)于人胃粘膜上皮細(xì)胞Dp71蛋白的消減效率。
　　(3)采用cck8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染了Dp71的RNA干擾質(zhì)粒人胃粘膜上皮細(xì)

4、胞，轉(zhuǎn)染了Dp71真核表達(dá)質(zhì)粒的SGC-7901細(xì)胞的活力與增殖能力。探討Dp71的可能抑癌機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1) Real-time PCR，western blot和免疫組織化學(xué)和結(jié)果顯示:Dp71在胃癌組織的表達(dá)明顯低于癌旁組織。免疫組化結(jié)果表明:Dp71蛋白表達(dá)改變與胃癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)，而與性別，年齡，浸潤(rùn)深度，TNM分期，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤大小無關(guān)。
　　(2)和人胃粘膜上皮細(xì)胞GES

5、-1相比，胃癌細(xì)胞株AGS，SGC-7901，BGC-823的Dp71的mRNA和蛋白表達(dá)降低。
　　(3)成功構(gòu)建Dp71的RNA干擾質(zhì)粒，于人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)中轉(zhuǎn)染Dp71干擾質(zhì)粒，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力改變，發(fā)現(xiàn)干擾Dp71后，細(xì)胞增殖活力沒有改變。
　　(4)胃癌細(xì)胞SGC-7901轉(zhuǎn)染Dp71真核表達(dá)質(zhì)粒Dp71f，Dp71d，和轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和空白SGC-7901細(xì)胞株相比，在48小時(shí)，72小時(shí)呈現(xiàn)出增殖能力