ActivinA通路對(duì)卵圓細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文內(nèi)容分為三部分進(jìn)行介紹：
　　第一部分
　　2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中activinA通路變化的研究
　　目的:研究2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中activinA通路的變化,以及與卵圓細(xì)胞增殖的關(guān)系。
　　方法:建立2-乙酰胺基芴/部分肝切除卵圓細(xì)胞增殖模型,肝切除后不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,取肝組織。熒光定量 PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)肝組織中activinA,activinA抑制物卵泡抑素、activinA

2、I型受體(AVR1)、activinA II型受體(AVR2)的表達(dá)變化,免疫組織化學(xué)檢測(cè) Pan-CK陽(yáng)性卵圓細(xì)胞的增殖情況以及activinA和卵泡抑素的表達(dá)。
　　結(jié)果:在2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中,肝切除后肝切除后9d卵圓細(xì)胞數(shù)量到達(dá)頂峰,肝切除后第12天卵圓細(xì)胞數(shù)量開始下降,逐步減少甚至消失。肝切除后,直至肝切除第9d-12dactivinA的表達(dá)量迅速上升并在肝切除后第12d上升至頂峰,肝切除15d后 activ

3、inA的表達(dá)逐漸下降直至正常水平。在未肝切除的正常對(duì)照大鼠肝組織中卵泡抑素的表達(dá)非常低,而在肝切除后第二天,卵泡抑素表明顯增加,主要表達(dá)于匯管區(qū)的肝細(xì)胞細(xì)胞漿,肝切除后第4d,卵泡抑素表達(dá)量下降至正常值。肝切除后早期(0-9d)AVR1mRNA的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異,直至9d以后 AVR1mRNA表達(dá)水平快速升高,至12dAVR1mRNA表達(dá)達(dá)到高峰,并維持至15d,隨后表達(dá)量明顯下降,至肝切除后21dAVR1mRNA表達(dá)水平將至正常范圍

4、。AVR2 mRNA在肝切除后表達(dá)隨即下調(diào),在肝切除后1d下降至對(duì)照水平以下,隨后 AVR2 mRNA的表達(dá)逐漸上升并在肝切除后15d到達(dá)頂峰,隨后逐步下降,至肝切除后21d恢復(fù)至對(duì)照組水平。
　　結(jié)論:在肝切除后卵圓細(xì)胞增殖的早期,由于卵泡抑素的高表達(dá)和activinA及其受體的低表達(dá),殘肝中activinA通路活性較低;在卵圓細(xì)胞增殖的終止階段,activinA通路的活性增高。提示 activinA可能是卵圓細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因

5、子。
　　第二部分
　　activinA通過(guò) smad通路抑制卵圓細(xì)胞增殖
　　目的:體外研究 activinA對(duì)卵圓細(xì)胞系 LE6增殖的調(diào)控作用并探討可能的機(jī)制。
　　方法:首先用不同濃度梯度的activinA處理LE6細(xì)胞,采用CCK-8,Brdu incorporation檢測(cè),annexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) LE6細(xì)胞增殖、凋亡的變化;然后使用200ng/ml activinA處理LE6細(xì)胞,使用w

6、estern-blot檢測(cè) LE6細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化和ERK、JNK、P38 MAPK通路的激活,western-blot、co-IP檢測(cè) smad通路的激活;使用shRNA沉默 LE6細(xì)胞中的smad4,觀察阻斷 smad通路后 LE6細(xì)胞對(duì) activinA的反應(yīng);使用卵泡抑素阻斷 activinA與其受體的結(jié)合,觀察 LE6細(xì)胞增殖的變化。
　　結(jié)果：ActivinA可以抑制LE6細(xì)胞的增殖,但并不誘導(dǎo)明顯的凋亡。

7、ActivinA可以下調(diào) LE6細(xì)胞中cyclinE及cyclinD1的表達(dá),并上調(diào) p15和p21的表達(dá),降低 Rb磷酸化;activinA可以激活 smad通路,但對(duì) MAPK通路沒(méi)有顯著影響;卵泡抑素或沉默smad4可以阻斷 activinA對(duì)卵圓細(xì)胞增殖的抑制作用,并阻斷 activinA對(duì)下游基因的調(diào)控作用。
　　結(jié)論：ActivinA可以通過(guò)激活 smad通路下調(diào) cyclinE及cyclinD1的表達(dá),并上調(diào) p15

8、和p21的表達(dá),抑制cylinD-CDK4/6復(fù)合物和cyclinE-CDK2復(fù)合物的形成,下調(diào)其活性,從而降低 Rb磷酸化,阻止 E2F的釋放,使細(xì)胞周期阻滯于 G1期,抑制細(xì)胞的增殖。
　　第三部分
　　門靜脈注射卵泡抑素可以促進(jìn)卵圓細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟再生
　　目的：體內(nèi)研究門靜脈注射卵泡抑素對(duì)2-乙酰胺基芴/部分肝切除模型中卵圓細(xì)胞增殖的作用。
　　方法：動(dòng)物分為卵泡抑素組和對(duì)照 NS組。卵泡抑素組在部分肝切除

9、后經(jīng)門靜脈給予1mg卵泡抑素,對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。肝切除后不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,切取殘肝組織,免疫組織化學(xué)檢測(cè) Pan-CK陽(yáng)性卵圓細(xì)胞數(shù)量和Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算肝臟/體重比評(píng)估肝臟再生情況。
　　結(jié)果：肝切除后第4天-12天,卵泡抑素組大鼠肝組織中Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照 NS組;肝切除后6-15天卵泡抑素組 Pan-CK陽(yáng)性卵圓細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組;肝切除后第9-15天卵泡抑素組肝臟/體重比明顯高于對(duì)照 NS