環(huán)境因素誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：小鼠卵圓細(xì)胞增殖模型的建立及卵圓細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：建立一種穩(wěn)定的成體小鼠肝臟卵圓細(xì)胞的誘導(dǎo)、分離和培養(yǎng)方法，并對分離培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞加以鑒定。
　　 方法：喂飼2-乙酰氨基芴（2-AAF）＋部分肝切除（PH）方法誘導(dǎo)小鼠肝臟卵圓細(xì)胞的增殖。改良的經(jīng)門靜脈灌注膠原酶消化法和等密度離心法分離純化卵圓細(xì)胞，并在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)。采用免疫熒光、RT-PCR和糖原染色等方

2、法對培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞加以鑒定。
　　 結(jié)果：此模型中肝臟有明顯的卵圓細(xì)胞增殖。分離的卵圓細(xì)胞為大小不一、為異質(zhì)性的，代表了肝臟卵圓細(xì)胞的所有亞群。體外培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞呈集落樣生長，穩(wěn)定傳代并已培養(yǎng)至3個(gè)月。免疫熒光、RT-PCR和糖原染色證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為卵圓細(xì)胞，并顯示該細(xì)胞具有分化潛能。
　　 結(jié)論: 2-AAF＋2/3肝切除方法同樣可以誘導(dǎo)小鼠肝臟卵圓細(xì)胞的增殖。本文所用方法是一種穩(wěn)定的成體小鼠卵圓細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，

3、為原發(fā)性肝癌的卵圓細(xì)胞源性相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第二部分：Toll樣受體2信號通路在AFB1誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞增殖過程中的作用
　　 目的:研究AFB1誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞增殖的情況，探討Toll樣受體2（TLR2）信號通路在AFB1誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞增殖中的表達(dá)變化和意義。
　　 方法:采用腹腔注射AFB1的方法建立AFB1誘癌的小鼠模型。檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)濃度變化；免疫組化方法檢測肝臟組織內(nèi)

4、卵圓細(xì)胞增殖的情況；使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)肝組織TLR2、髓樣分化因子（MyD88）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）和AFP mRNA的表達(dá)情況；Western blot方法檢測肝組織TLR2、MyD88和核因子-κBp65（NF-κBp65）的表達(dá)情況；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1、IL-6和HGF的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:在此模型中，3小時(shí)時(shí)ALT和AS

5、T即有明顯升高，隨后逐漸升高，30天時(shí)達(dá)到高峰，隨后有所下降，但明顯高于對照組（P<0.05）。對照組肝組織內(nèi)未見卵圓細(xì)胞的增殖，AFB1組肝組織7天時(shí)卵圓細(xì)胞開始增殖，一直持續(xù)到60天。TLR2、MyD88和NF-κB及其下游細(xì)胞因子在此過程中表達(dá)明顯增高（P<0.05）。
　　 結(jié)論: AFB1可以引起明顯肝臟損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)小鼠肝臟卵圓細(xì)胞的增殖。TLR2信號通路可能通過啟動下游細(xì)因子的釋放在卵圓細(xì)胞的增殖過程中起著重要作用

6、。深入研究TLR2信號通路可能為卵圓細(xì)胞的增殖和肝癌發(fā)生的研究提供新的理論依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。
　　 第三部分：環(huán)境因素誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞增殖過程中肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞基因的表達(dá)變化
　　 目的:建立HBV、AFB1和兩者協(xié)同誘導(dǎo)肝癌的動物模型，監(jiān)測肝臟卵圓細(xì)胞的增殖。研究此過程中肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞基因表達(dá)的差異，為肝癌的干細(xì)胞理論尋找新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法: 40只Balb/c小鼠和40只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠分為四組：對照

7、組（A組）、AFB1組(B組)、HBV組(C組)和AFB1+HBV組(D組)。AFB1150mg/kg，腹腔注射。檢測HBsAg定量、HBeAg半定量和乙肝五項(xiàng)，明確HBV轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因是否有效。檢測各組血清ALT和AST的濃度變化；免疫組化檢測肝臟卵圓細(xì)胞增殖情況。6個(gè)月后剖殺動物，采用本試驗(yàn)室改良的方法分離和培養(yǎng)四組的肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞。抽提總RNA，Illumina小鼠基因芯片檢測四組內(nèi)肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞的基因表達(dá)變化。
　　

8、 結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測：血清HBsAg250.00IU/mL（陽性≥0.05IU/mL），HBeAg1.66S/CO（陽性≥1.00S/CO），HBsAg抗體（－），HBeAg抗體（－），HBcAg抗體（－）。(2)各組死亡率：正常組為0%(0/20),AFB1組為30％（6/20），HBV組為10％（2/20），AFB1+HBV組為60％（12/20）。后三組明顯高于正常組,AFB1+HBV組明顯高于AFB1和HBV組（P<0

9、.05）。(3)肝功能的變化：正常組肝功能無明顯變化，AFB1、HBV組出現(xiàn)明顯肝臟損傷，兩者協(xié)同引起肝臟損傷進(jìn)一步加重（P<0.05）。(4)卵圓細(xì)胞的增殖：正常組肝組織中未發(fā)現(xiàn)卵圓細(xì)胞增殖；后三組肝組織中有明顯卵圓細(xì)胞增殖，呈團(tuán)索狀，主要分布于門脈區(qū)。(5)與正常組比較，AFB1組卵圓細(xì)胞有1577個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)變化；肝細(xì)胞出現(xiàn)了805個(gè)。HBV組卵圓細(xì)胞有3467個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)變化；肝細(xì)胞出現(xiàn)1196個(gè)。AFB1+HBV組卵圓細(xì)胞

10、，有4846個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)變化；肝細(xì)胞出現(xiàn)2542個(gè)。其中涉及Notch、Wnt、PI3K-AKT等數(shù)十個(gè)信號通路。AFB1、HBV均引起卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞癌基因和抑癌基因的表達(dá)變化，其中卵圓細(xì)胞表達(dá)升高的癌基因明顯多于肝細(xì)胞，而抑癌基因明顯少于肝細(xì)胞；兩者協(xié)同導(dǎo)致這種效果更加明顯。
　　 結(jié)論:(1)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)有穩(wěn)定、高滴度的HBV病毒合成。(2)AFB1、HBV和兩者協(xié)同作用于小鼠均可引起明顯的肝臟卵圓細(xì)胞增殖，并可導(dǎo)致死