大鼠肝卵圓細(xì)胞的增殖模型建立和體外分離的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝干細(xì)胞在理論研究和臨床應(yīng)用都有重要意義。一方面，肝干細(xì)胞可能參與肝臟嚴(yán)重?fù)p傷后的再生與修復(fù)，因此，肝干細(xì)胞的增殖與分化及其機(jī)理的研究，有助于闡明肝臟的發(fā)育機(jī)制。另一方面，肝干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力，并能分化為肝細(xì)胞，這將為肝病的細(xì)胞移植、組織工程和基因治療帶來(lái)新的希望。肝組織是否存在肝干細(xì)胞的問(wèn)題一直在爭(zhēng)論，由于肝干細(xì)胞缺乏特異性表面標(biāo)記物，給肝干細(xì)胞的分離和鑒定帶來(lái)很大困難。成年肝組織的肝干細(xì)胞數(shù)量很少，且處于休眠期，要獲取足量且存

2、活率高的肝干細(xì)胞，必須建立良好的激活模型。 目的 建立大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖模型，進(jìn)一步進(jìn)行肝干細(xì)胞的分離、純化和鑒定。 方法 選擇81只體重200±20g的雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。采用2-AAF+2／3肝切除方法(2-acetylaminofluorene+two thirds partial hepatectomy，2-AAF+2／3PH)建立肝卵圓細(xì)胞增殖模型。使用不同劑量的2—AAF通過(guò)胃管

3、灌喂，5天后行肝2／3切除，術(shù)后第二天各組按各自劑量繼續(xù)灌喂，并于術(shù)后第4h、4d、8d、12d、16d不同的時(shí)間點(diǎn)取肝組織，光鏡及電鏡下觀察肝干細(xì)胞增殖情況，并行免疫組織化學(xué)染色。利用膠原酶原位灌注及Percoll密度梯度離心分離大鼠肝卵圓細(xì)胞，并把分離細(xì)胞置于37℃5％CO<,2>孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞在倒置顯微鏡、電鏡下觀察細(xì)胞特點(diǎn)，免疫組織化學(xué)染色鑒定肝卵圓細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志。 結(jié)果 不同劑量的二乙酞氨基芴連續(xù)灌胃4天，第5天行2

4、/3肝部分切除，后繼續(xù)給予相同劑量12天能建立較理想的肝卵細(xì)胞增殖模型，病理切片HE染色可見(jiàn)匯管區(qū)及中央靜脈周?chē)罅吭鲋车氖葔A性小細(xì)胞，電鏡下觀察此種細(xì)胞具有卵圓形細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)少而淡、核/漿比例較大等特點(diǎn)，免疫組化染色證實(shí)AFP、CK19、OV6、MAP kinases為陽(yáng)性。新鮮分離的細(xì)胞體積較小，約為正常肝細(xì)胞小于1/3，電鏡下觀察細(xì)胞表面可見(jiàn)少量短而小的微絨毛狀突起，有卵圓形細(xì)胞核特點(diǎn)、核/漿比例較大。免疫組化檢查顯示新鮮分離的