小鼠肝臟卵圓細胞增殖和凋亡機制的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：2-AAF+2/3PH誘導成體小鼠卵圓細胞模型的建立及卵圓細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：建立穩(wěn)定的誘導成體小鼠肝臟卵圓細胞的增殖模型，及穩(wěn)定高效對卵圓細胞進行分離和培養(yǎng)的方法，觀察卵圓細胞的增殖能力，生物學特性，對小鼠肝臟卵圓細胞標志物進行實驗室檢測，并證明其分化潛能。
　　 方法：利用喂飼2-乙酰氨基芴(2-AAF)＋2/3肝大部分切除方法誘導小鼠肝臟卵圓細胞的增殖。經

2、改良的經門靜脈灌注膠原酶消化，等密度Percoll離心法分離卵圓細胞，并在體外進行長期培養(yǎng)。運用免疫組織化學染色觀察卵圓細胞的增殖情況，流式細胞儀檢測分析，免疫熒光、RT-PCR和糖原染色對分離培養(yǎng)的卵圓細胞表型加以鑒定。
　　 結果：增殖模型中的肝臟組織中可以發(fā)現(xiàn)有明顯的卵圓細胞增殖，并能夠分離培養(yǎng)出穩(wěn)定傳代的卵圓細胞。分離并體外培養(yǎng)的卵圓細胞呈集落樣生長，呈鋪路石樣，卵圓細胞體積較小，細胞胞漿少，體積大小不均一，核漿比例大，

3、為正常肝細胞的約1/3大小，細胞直徑為8-10μm。運用流式細胞儀檢測，免疫熒光、RT-PCR和糖原染色技術對體外培養(yǎng)的卵圓細胞進行鑒定，證實培養(yǎng)的細胞表達CK19,PKM2，C-kit,CX32,CX43,AFP,ALB,AML-1等抗原，證實該細胞確為卵圓細胞，該細胞具有向肝細胞和膽管上皮細胞分化的潛在能力。
　　 結論：運用2-AAF+2/3PH的方法可以穩(wěn)定誘導小鼠卵圓細胞的增殖，改良的經門靜脈灌注膠原酶消化，等密度Pe

4、rcoll離心法可以高效的分離卵圓細胞，分離出的卵圓細胞可以在體外進行長期培養(yǎng)。本方法為少數(shù)能夠順利誘導小鼠體內卵圓細胞增殖活化，并能夠穩(wěn)定分離和培養(yǎng)出卵圓細胞的方法之一，為在多品系實驗性嚙齒類動物的肝癌研究奠定研究基礎。
　　 第二部分：小鼠卵圓細胞Trx2的表達以及Notch信號通路在卵圓細胞內表達的變化
　　 目的：研究卵圓細胞硫氧還蛋白2的表達和Notch信號通路在卵圓細胞內的表達變化，探討卵圓細胞的抗凋亡以及增

5、殖分化的機制。
　　 方法：利用喂飼2-乙酰氨基芴(2-AAF)＋2/3肝大部分切除方法誘導小鼠肝臟卵圓細胞的增殖，建立對照組，處理組4d，6d，8d時間點的小鼠實驗模型。免疫蛋白印跡，熒光實時定量PCR檢測卵圓細胞和肝細胞的Trx2的表達，TUNEL法檢測其凋亡?；蛐酒夹g檢測Notch信號通路相關基因的表達變化。
　　 結果：小鼠肝臟卵圓細胞內的Trx2的表達量明顯升高，處理組6d時間點表達量最高，卵圓細胞的凋亡率