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文檔簡介
1、一、背景和目的:
在肝膽外科臨床中,膽管梗阻、膽汁淤積是常見的病理環(huán)境,較長時(shí)間梗阻,可誘發(fā)永久性肝損害,甚至發(fā)展成肝纖維化及肝硬化,是臨床治療的難題,相關(guān)發(fā)病機(jī)制基礎(chǔ)研究有現(xiàn)實(shí)意義。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類慢性肝病組織如肝硬化、亞急性肝壞死后肝再生、兒童先天性肝外膽管閉鎖、遺傳性血色病、慢性病毒性肝炎、原發(fā)性肝癌中都存在類似于卵圓細(xì)胞的肝前體細(xì)胞。這種肝前體細(xì)胞定位于匯管區(qū)、纖維間隔、匯管區(qū)旁肝實(shí)質(zhì)、假小葉及炎癥邊界
2、。隨著肝臟卵圓細(xì)胞特異性標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn),卵圓細(xì)胞相關(guān)研究成為熱點(diǎn),特別是肝臟卵圓細(xì)胞參與肝臟損傷修復(fù)、肝臟纖維化的相關(guān)研究。另外有研究證明多種組織器官的纖維化進(jìn)程中伴隨著胚胎發(fā)育相關(guān)基因及多種細(xì)胞因子的重新激活。這些為研究肝臟損傷的保護(hù)、治療及肝纖維化的形成機(jī)制提供了最新途徑。
因此,本研究通過結(jié)扎Wistar大鼠膽總管,模擬膽管梗阻病理狀態(tài),通過免疫組化、PCR技術(shù),探討這一病理過程相關(guān)細(xì)胞因子和肝臟卵圓細(xì)胞在膽管梗阻肝臟
3、纖維化過程中發(fā)揮的作用。
二、材料與方法:
雄性Wistar大鼠60只,體重250-300克,健康,無明顯畸形,將動(dòng)物隨機(jī)分成兩組,一組(30只)作為實(shí)驗(yàn)組實(shí)施近肝門端膽總管單線結(jié)扎(BDL術(shù));另一組(30只)作為對(duì)照組實(shí)施假手術(shù),開腹游離膽總管但不結(jié)扎。術(shù)后相同條件下飼養(yǎng)。分別于術(shù)后第1天、2天、3天、7天、14天、21天處死大鼠,每組各處死5只,取肝右葉應(yīng)用4%多聚甲醛固定,留作免疫組化;取肝左葉-80
4、℃凍存,留作RT-PCR檢測(cè)。
1、通過肉眼及HE染色觀察膽管梗阻不同時(shí)間點(diǎn)肝臟形態(tài)改變。
2、通過免疫組化,OV-6標(biāo)記卵圓細(xì)胞,觀察不同時(shí)間點(diǎn)卵圓細(xì)胞的數(shù)目、分布。
3、通過PCR檢測(cè)各目的基因:轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1、TGF-α),肝細(xì)胞生長因子(HGF),膠原蛋白Ⅰ(COLⅠ),觀察不同時(shí)間點(diǎn)各基因的表達(dá)情況。
三、結(jié)果:
1、大體結(jié)果
Wi
5、star大鼠膽管梗阻后可見肝臟黃染并腫脹,肝臟淤血、水腫。福爾馬林固定后部分大鼠的肝葉標(biāo)本,可見表面粗糙,顏色灰白等肝組織早期肝纖維化的表現(xiàn)。對(duì)照組:肝臟標(biāo)本各肝葉色澤紅潤,表面光滑。
2、HE染色結(jié)果:
術(shù)后第1天見少量嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤;術(shù)后第2天少許新增生無管腔的小膽管,少量嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤;術(shù)后第3天新增生的細(xì)小膽管和無管腔的小膽管,嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤較術(shù)后第2天明顯增加,肝
6、細(xì)胞輕度變性,可見灶狀和片狀壞死,肝組織匯管區(qū)可見膽管增生和纖維組織細(xì)胞增生,偶見膽管擴(kuò)張;術(shù)后第7天肝細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死發(fā)生率增加及程度加重,重者見片狀出血和壞死,肝組織門區(qū)可見膽管增生和纖維細(xì)胞增生;術(shù)后14天小葉結(jié)構(gòu)受到破壞,可見肝細(xì)胞空泡變性及壞死;術(shù)后21天小葉結(jié)構(gòu)破壞更加嚴(yán)重,大量肝細(xì)胞壞死。隨時(shí)間進(jìn)展肝臟損傷、纖維化程度逐漸加重。
3、免疫組化結(jié)果
OV-6免疫組化陽性染色的細(xì)胞數(shù)目及分布范圍隨著
7、梗阻時(shí)間的延長而增加,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有明顯差異。OV-6陽性細(xì)胞表達(dá)部位主要位于匯管區(qū)膽管及肝間質(zhì)新增生膽管及無管腔的小膽管細(xì)胞胞漿中。
4、RT-PCR結(jié)果
在對(duì)照組和BDL組大鼠肝臟中均能檢測(cè)出目的基因的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析顯示兩組TGF-β1、COLⅠ的表達(dá)差異從第1天開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BDL組與對(duì)照組中HGF及TGF-α的表達(dá)差異從第3天開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)BDL不同天數(shù)組間的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)COLⅠ、TGF-
8、β1在3-7天無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,HGF在1-3天、7-21天,TGF-α在1-2、7-21天無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而其他相鄰各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,COLⅠ、TGF-β1指標(biāo)1-3天增長趨勢(shì)最明顯,TGF-α、HGF指標(biāo)3-7天增長趨勢(shì)最明顯。
四、結(jié)論:
1、研究發(fā)現(xiàn)肝外膽管結(jié)扎造成膽管梗阻的大鼠模型,其肝臟呈現(xiàn)膽汁淤積性、進(jìn)行性加重的纖維化表現(xiàn)。卵圓細(xì)胞參與膽管梗阻后損傷的修復(fù)過程,其時(shí)序性變化趨勢(shì)與抗肝臟纖維化的細(xì)胞
9、因子變化趨勢(shì)相似,可能參與抗纖維化過程。
2、研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組肝臟纖維化相關(guān)基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組,并且隨著梗阻天數(shù)的增加表達(dá)量增加,其中COLⅠ可顯示纖維化的進(jìn)程,TGF-β1與促進(jìn)肝臟纖維化過程有關(guān),TGF-α、HGF與對(duì)抗肝臟纖維化過程有關(guān)。
3、研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化過程中的3-7天是纖維化過程的特殊時(shí)期,第3天之前以促纖維化過程為主要表現(xiàn);第3天開始出現(xiàn)抗纖維化表現(xiàn),促纖維化趨勢(shì)減弱,纖維化速度減慢;第7
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