GSK-3β在大鼠肝卵圓細(xì)胞活化、增殖中作用的研究.pdf

1、研究背景： 糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)在剛發(fā)現(xiàn)的時(shí)候只認(rèn)為僅參與肌肉能量?jī)?chǔ)存和新陳代謝。但隨著研究的逐步加深，發(fā)現(xiàn)該酶參與多種信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，其靶蛋白包括胞漿蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、腫瘤形成等多方面發(fā)揮重要作用[1]。迄今，多種GSK-3作用底物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，其中包括糖原合成酶、轉(zhuǎn)錄起始因子eIf2、熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄因子(HSF21)、蛋白激酶A(PKA)

2、、癌基因(c-Jun、c-Myc、c-myb)、反應(yīng)結(jié)合蛋白(CREB)等[1]。目前，腫瘤的發(fā)病原因尚未弄清，但很多證據(jù)表明在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，有大量信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常激活或抑制，涉及多種蛋白的異常表達(dá)增加或降低，其中GSK-3就是比較重要的一種。目前已知GSK-3家族包括兩個(gè)成員，GSK-3α和GSK-3β[2]。 肝臟是功能復(fù)雜的消化器官，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類等生物大分子的代謝、解毒、分泌等重要功能。肝臟器官容易

3、受到不慎攝入的外界有害物質(zhì)的損傷。肝臟具有很強(qiáng)的再生功能，在正常生理狀態(tài)下或輕度肝損時(shí)，肝細(xì)胞參與增殖和分化，維持肝臟的正常功能。目前已有大量的實(shí)驗(yàn)表明，廣泛和慢性的肝損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞大量破壞或肝細(xì)胞的增殖能力被抑制時(shí)，肝組織中可觀察到卵圓細(xì)胞的增殖和分化。這種細(xì)胞具有肝臟干細(xì)胞的特性，可以在一定條件下分化為成熟的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，但它未見于正常的成體肝臟中。肝臟干細(xì)胞在理論研究和臨床應(yīng)用都有重要意義。肝臟干細(xì)胞可能參與肝臟損傷后的再生和

4、修復(fù)，因此其增殖和分化機(jī)理的研究有助于闡明肝臟發(fā)育機(jī)制。另外，肝臟強(qiáng)大的增殖能力，并可分化為肝細(xì)胞，這將為肝衰或肝病時(shí)細(xì)胞移植、組織工程和基因治療帶來新的希望。 GSK-3β在WNT、NF-κB、SHH、Notch等信號(hào)通路中參與重要的作用，而GSK-3β在肝臟干細(xì)胞(卵圓細(xì)胞)中的研究目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，本課題旨在研究GSK-3β在肝臟卵圓細(xì)胞活化、增殖中的表達(dá)和意義。 目的： 1、建立肝臟卵圓細(xì)胞活化、增

5、殖模型。 2、檢測(cè)GSK-3β及磷酸化的GSK-3β在肝臟卵圓細(xì)胞活化、增殖過程中的表達(dá)。 方法： 取健康雄性SD大鼠54只，體重150-180g(溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分成2組，每組27只，實(shí)驗(yàn)組(2-AAF/PH組)用玉米油將2-乙酰胺基芴配成1％濃度，通過胃管每日15mg/kg體重灌胃連續(xù)4d，對(duì)照組(PH組)同樣單純用玉米油灌胃，同時(shí)于第5天停喂，在水合氯醛(10％)麻醉下行肝臟2/3切除。第6天

6、繼續(xù)灌胃。肝臟2/3切除時(shí)定為Oh，分別于手術(shù)后0h、1h、6h、12h、24h、48h、72h、120h、168h處死動(dòng)物(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只)，并取部分肝臟迅速置入液氮罐中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中，以備提取組織中蛋白。另取一部分入10％福爾馬林液固定，做石蠟包埋切片，HE染色觀察卵圓細(xì)胞增生情況，免疫組化檢測(cè)OV6，c-kit、PCNA以明確模型建立是否成功，并通過免疫組化檢測(cè)GSK-3β及磷酸化的GSK-3β表達(dá)。提取各時(shí)段肝組織中

7、的蛋白，用于Western blot檢測(cè)GSK-3β、磷酸化的GSK-3β以及內(nèi)參β-actin表達(dá)，將膠片進(jìn)行掃描，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析P-Ser9GSK-3β光密度值、總GSK-3β光密度值及β-actin光密度值，得出結(jié)論。 結(jié)果： 1、肝卵圓細(xì)胞活化模型建立：2-AAF/PH大鼠肝切除后第4天開始可見膽管增生反應(yīng)和膽管周圍的卵圓細(xì)胞活化，于第9天最明顯。卵圓細(xì)胞增生部位多位于匯管區(qū)及小葉

8、間膽管附近，所見到的肝卵圓細(xì)胞體積較小，卵圓細(xì)胞核呈卵圓形，胞質(zhì)較少，嗜酸性弱。肝卵圓細(xì)胞大小及分布不均勻，呈簇狀分布，且由匯管區(qū)向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)延伸。免疫組化染色結(jié)果顯示，肝卵圓細(xì)胞漿OV6染色陽性，c-kit、PCNA也為陽性。 2、免疫組化檢測(cè)GSK-3β及磷酸化GSK-3β表達(dá)：2-AAF/PH組中的肝臟卵圓細(xì)胞細(xì)胞核與細(xì)胞漿均有表達(dá)GSK-3β，磷酸化GSK-3β未見明顯表達(dá)。PH組肝細(xì)胞見GSK-3β表達(dá)于細(xì)胞漿。

9、 3、Western blot檢測(cè)GSK-3β及磷酸化GSK-3β表達(dá)：2-AAF/PH組中肝臟切除前，GSK-3β即有表達(dá)，隨后表達(dá)量升高，6小時(shí)后下降，12小時(shí)降至最低點(diǎn)，24小時(shí)后開始升高，120小時(shí)達(dá)到高峰，168小時(shí)又開始降低，伴隨著GSK-3β的變化，Ser9GSK-3β在2-AAF/PH組肝切除前便開始磷酸化，12小時(shí)后磷酸化最明顯，隨著時(shí)間點(diǎn)下降直至消失。 結(jié)論： 1、通過2-AAF/PH模型可以成功的建