GSK-3β在高糖環(huán)境下足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效應(yīng)中的作用.pdf

1、背景：
　　 糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stagerenaldisease，ESRD)的重要原因。蛋白尿是DN最常見的臨床表現(xiàn)，也是糖尿病腎病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此減少蛋白尿是糖尿病腎病治療的重要舉措。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)贒N蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵的作用。足細(xì)胞參與蛋白尿形成的原

2、因很多，機(jī)制復(fù)雜。作為一種終末分化的臟層上皮細(xì)胞，足細(xì)胞在某些刺激物的作用下可通過特定程序向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，但足細(xì)胞在高糖環(huán)境下是否發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化以及足細(xì)胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化是否參與蛋白尿的形成尚不清楚。
　　 目前研究認(rèn)為，有三條信號(hào)通路介導(dǎo)了足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程，即TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-catenin，而廣泛存

3、在于真核生物體內(nèi)的糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase3β，GSK-3β)是以上三條通路的參與者，但其是否參與高糖環(huán)境下足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化目前尚不明確。
　　 無機(jī)離子鋰（本課題使用氯化鋰）是一種治療狂躁和抑郁癥的藥物，是GSK-3β的選擇性活性抑制劑，通過鋰的作用，抑制高糖環(huán)境下GSK-3β的活性，并觀察足細(xì)胞表型和功能的變化，或許能為糖尿病腎病蛋白尿?qū)ふ倚碌闹委煱悬c(diǎn)。
　　 目的：
　　

4、 本實(shí)驗(yàn)通過觀察高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞表型和功能的改變、GSK-3β表達(dá)量和活性的改變、以及抑制GSK-3β活性和表達(dá)量后足細(xì)胞表型和功能的變化，來研究GSK-3β在高糖環(huán)境下足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效應(yīng)中的作用，并為糖尿病腎病蛋白尿的治療尋找新的靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 以條件永生化小鼠足細(xì)胞為研究對(duì)象。
　　 1.高糖環(huán)境下檢測(cè)足細(xì)胞表型和功能:
　　 (1)不同濃度葡萄糖對(duì)足細(xì)胞表型的影響:用含不同濃度葡萄糖

5、(12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理足細(xì)胞36h，并設(shè)正常對(duì)照組(5.6mmol/L葡萄糖)和高滲對(duì)照組（5.6mmol/L葡萄糖+44.4mmol/L甘露醇），采用Western-blot與間接免疫熒光的方法檢測(cè)足細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白nephrin，podocin和間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物α-SMA，F(xiàn)ibronectin的表達(dá);
　　 (2)不同濃度葡萄糖刺激足細(xì)胞36h后白蛋白流入量的變化:將分化成熟的足細(xì)胞以

6、一定密度(5×103)接種于transwell小室上層的聚酯纖維膜上，待細(xì)胞融合后，換無血清培養(yǎng)基饑餓8小時(shí)，然后使用含不同濃度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理足細(xì)胞36小時(shí)，36h后使用滅菌PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后給Transwell濾過膜的上部換上0.3ml的RPMI1640培養(yǎng)基，下部充滿1ml含40mg/ml胎牛血清白蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃孵育1小時(shí)后，取上層培養(yǎng)液，用BCA

7、蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濾過膜上部培養(yǎng)基的白蛋白濃度，即白蛋白流入量。
　　 2.高糖環(huán)境下足細(xì)胞GSK-3β表達(dá)量及活性的變化:
　　 (1)不同濃度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/LGlu)處理足細(xì)胞36h后，用Western-blot檢測(cè)GSK-3β及其9位絲氨酸位點(diǎn)pSer9GSK-3β（抑制位點(diǎn)）的表達(dá)量以及216位酪氨酸位點(diǎn)pTyr216GSK-3β（活化位點(diǎn)）的表達(dá)量;
　　 (2)不同

8、糖濃度處理的足細(xì)胞GSK-3β活性的變化:足細(xì)胞按上述濃度分組培養(yǎng)36h后，按照GSK-3β活性檢測(cè)試劑盒（GenmedScientific，美國）說明書處理足細(xì)胞，依次加入各種試劑，于分光光度計(jì)上檢測(cè)各組樣品的OD值，按試劑盒說明書給出的公式計(jì)算GSK-3β的活性。
　　 3.應(yīng)用siRNA干擾GSK-3β后檢測(cè)足細(xì)胞表型及功能:
　　 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的小鼠的GSK-3β全長基因(GeneBankNO.

9、NM-019827.6)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)的靶序列mRNA(5'-3')為:CCACTCAAGAACTGTCAAGTA.，陰性對(duì)照的siRNA正義鏈(5'-3')序列為:UUCUCCGAACGUGUCACGUtt。應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000（invitrogen，美國）將GSK-3βsiRNA以30nmol的濃度轉(zhuǎn)染足細(xì)胞36小時(shí)后檢測(cè)各組足細(xì)胞nephrin，podocin，α-SMA表達(dá)量的變

10、化;同時(shí)應(yīng)用Transwell檢測(cè)各組的白蛋白流入量以評(píng)估足細(xì)胞的單層屏障功能。
　　 4.應(yīng)用GSK-3β活性抑制劑后足細(xì)胞表型及功能的變化
　　 應(yīng)用LiCl，一種經(jīng)典的GSK-3β活性抑制劑，觀察抑制GSK-3β活性后足細(xì)胞表型及功能的變化，或許能為糖尿病腎病蛋白尿的臨床治療提供借鑒。將實(shí)驗(yàn)分為正常糖對(duì)照組(5.6mmol/LGlu)，正常糖+LiCl組，高糖組(25mmol/LGlu)、高糖+LiCl組，檢測(cè)各組

11、足細(xì)胞標(biāo)記蛋白nephrin，podocin，間充質(zhì)標(biāo)記蛋白α-SMA，F(xiàn)ibronectin的表達(dá)量，并應(yīng)用Transwell檢測(cè)各組足細(xì)胞的白蛋白流入量，觀察單層屏障功能的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.(1)Western-blot與間接免疫熒光結(jié)果均顯示:與高糖組相比，正常糖對(duì)照組和高滲對(duì)照組足細(xì)胞高表達(dá)nephrin，podocin，僅少量表達(dá)間充質(zhì)蛋白標(biāo)記物α-SMA，F(xiàn)ibronectin;對(duì)Western

12、-blot結(jié)果進(jìn)行灰度分析，發(fā)現(xiàn)nephrin，podocin的蛋白表達(dá)水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性下調(diào)(P＜0.05)，α-SMA的表達(dá)水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性上調(diào)(P＜0.05);(2)用Transwell測(cè)不同處理的足細(xì)胞白蛋白流入量，評(píng)估足細(xì)胞的單層屏障功能，發(fā)現(xiàn)與正常糖濃度組相比，高糖組白蛋白流入量增加，且隨葡萄糖濃度的升高呈計(jì)量依賴性上調(diào)(P＜0.05)。
　　 2.(1)Western-blot結(jié)果

13、顯示，與正常糖及高滲對(duì)照組相比，高糖組足細(xì)胞GSK-3β表達(dá)量增多，pSer9GSK-3β表達(dá)量減少，pTyr216GSK-3β表達(dá)量增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);(2)GSK-3β激酶活性檢測(cè)試劑盒顯示，與正常糖相比，經(jīng)高糖處理的足細(xì)胞GSK-3β活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.應(yīng)用GSK-3βsiRNA處理足細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用GSK-3βsiRNA處理組與陰性對(duì)照組及高糖對(duì)照組相比，足細(xì)胞表

14、面標(biāo)記蛋白nephrin，podocin表達(dá)量增多，間充質(zhì)標(biāo)記蛋白α-SMA表達(dá)減少;用Transwell檢測(cè)各組白蛋白流入量，發(fā)現(xiàn)處理組白蛋白流入量減少，單層屏障功能改善。
　　 4.高糖環(huán)境下，應(yīng)用GSK-3β活性抑制劑LiCl可以部分逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，改善足細(xì)胞的單層屏障功能。
　　 結(jié)論：
　　 1.足細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生轉(zhuǎn)分化（表型改變與功能受損）。
　　 2.GSK-3β參與高糖環(huán)境下足細(xì)胞