Cαq蛋白對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖作用的調(diào)控及機(jī)制研究.pdf

1、目的:1.明確Gαq蛋白對(duì)CD4+T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖的調(diào)控。2.闡明Gαq蛋白調(diào)控CD4+T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖的機(jī)制。
　　方法:1.建立骨髓嵌合鼠。同齡同性別Gαq基因敲除小鼠和wild C57BL/6小鼠進(jìn)行脫頸處死，取其雙下肢完整的股骨和脛骨，置于70％酒精中浸泡3分鐘，用無(wú)菌的PBS洗3次，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，用1ml注射器將骨髓吹出。然后應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，進(jìn)行骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)。分別取出4×106個(gè)細(xì)胞靜脈注射到100

2、0 cGy致死劑量輻照的同齡同性別wild C57BL/6小鼠中進(jìn)行骨髓移植，建立骨髓嵌合鼠，繼續(xù)在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)2個(gè)月，取脾臟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.分離、純化CD4+T細(xì)胞。同齡同性別Gαq基因敲除小鼠和wild C57BL/6小鼠或同批次的骨髓嵌合鼠的脾臟，經(jīng)研磨、過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。采用磁珠陽(yáng)選的方法分離CD4+T細(xì)胞。首先將脾臟單個(gè)核細(xì)胞與生物素標(biāo)記的anti-CD4在冰上孵育30分鐘，離心去除未結(jié)合的抗體

3、后，加入親和素包被的磁珠，冰上孵育30分鐘后，應(yīng)用Mini-MACS分選系統(tǒng)分別純化CD4+T細(xì)胞。純化的細(xì)胞在進(jìn)行研究前，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行純度鑒定，未達(dá)到95％時(shí)可用新的分選柱進(jìn)行再次純化。3.檢測(cè)CD4+T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖及其影響因素。應(yīng)用上述分選方法分選Gαq基因敲除小鼠和wild C57BL/6小鼠的CD4+T細(xì)胞。在體外進(jìn)行CFSE標(biāo)記后，以每只小鼠分別給予靜脈注射4×106個(gè)細(xì)胞的劑量，靜脈注射給同齡同性別300 cGy亞致死

4、劑量輻照的wild C57BL/6小鼠，在不同時(shí)間點(diǎn)，取其脾臟進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)根據(jù)CFSE熒光強(qiáng)度檢測(cè)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)增殖。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:取8-12周齡同性別C57BL/6小鼠20只，分成2組，每組10只，均給予300 cGy亞致死劑量輻照。第一組每只靜脈注射4×106 CFSE標(biāo)記的Gαq基因敲除小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞;第二組每只靜脈注射4×106 CFSE標(biāo)記的wild小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞;注射后的第2、5天每組取5只小鼠取其脾

5、臟細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析CFSE陽(yáng)性細(xì)胞的增殖，并分別進(jìn)行比較穩(wěn)態(tài)增殖的差異。純化的CD4+細(xì)胞T細(xì)胞在進(jìn)行穩(wěn)態(tài)增殖前及穩(wěn)態(tài)增殖的第2、5天用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行BTLA、CD62L表面標(biāo)記的檢測(cè)，并比較表達(dá)的差異。
　　結(jié)果:1.穩(wěn)態(tài)增殖前，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)比較，野生型與Gαq缺失型小鼠注射前CD4+T細(xì)胞表面BTLA、CD62L的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。2.CFSE染色后，通過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)比較，2天組中野生型組與Gα

6、q缺失組型小鼠CD4+T細(xì)胞增殖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。5天組Gα q缺失組型小鼠CD4+T細(xì)胞比野生組型小鼠CD4+T細(xì)胞增殖更多(P＜0.01)。3.通過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)比較，2天組中Gαq基因敲除組小鼠和野生型小鼠中CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞表面BTLA的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)、2天組野生型小鼠CD62L表達(dá)明顯高于Gαq基因敲除組小鼠(P＜0.01)。5天組Gαq基因敲除組小鼠中CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞表面B