新生兒腦膜炎大腸桿菌毒力島基因GimA的功能研究.pdf

1、目的：
　　 新生兒細(xì)菌性腦膜炎是兒科嚴(yán)重感染性疾病之一,臨床上盡管可以選用相應(yīng)的抗生素治療,但是病死率仍然得不到顯著的改善。幸存者常伴有失聽、失明、癲癇、智力和運動障礙后遺癥。因此,探討有效的新生兒細(xì)菌性腦膜炎的防治策略具有重要意義。
　　 大腸桿菌(Escherichia coll,E coli)是導(dǎo)致新生兒腦膜炎最常見的革蘭氏陰性致病菌。從腦膜炎患兒腦脊液中分離的大腸桿菌中,80％以上均帶有K1莢膜?，F(xiàn)已清楚,E.

2、coli K1通過血行播散入腦而引起腦膜炎。但是,血液中的E.coli K1如何穿過主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)組成的血腦屏障(blood brain barrier,BBB),迄今尚不清楚。借助于體外分離培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)單層--血腦屏障模型,

3、學(xué)者們先后鑒定了E.coli K1中的參與侵襲HBMECs相關(guān)基因,如fimH,ompA,ibeA,ibeB,CNF1等,并對參與E.coli K1侵襲相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如PI3K、PKB、PKC、RhoGTPase以及FAK等細(xì)胞骨架組裝調(diào)控信號分子等進行了探討。但已鑒定的這些E.coli K1穿過BBB的“決定因子”,特別是每個E.coli K1侵襲基因介導(dǎo)細(xì)菌侵襲HBMECs的功能差異、聯(lián)系、及詳細(xì)機制尚有待進一步研究。

4、r>　　 我們在先前的研究中,從致新生兒腦膜炎E.coli K1株RS218(O18:K1:H7)中克隆鑒定了一個E.coli K1毒力島基因GimA(genetic island of meningitic E.colicontaining ibeA)(圖1)。GimA全長20.3kb,僅存在于E.coli K1,其他非腦膜炎大腸桿菌中如E.coli K12均不含GimA序列。GimA含有四個操縱子,編碼15個基因:(1)ptnIP

5、KC(GimA1),包括ptnI、ptnP,ptnK、ptnC；(2)CglDTEC(GimA2),包括cglD、cglT、cglE、cglC;(3)GcxKRCI(GimA3),包括gcxK、gcxR、gcxC、gcxI；(4)IbeRAT(GimA4),包括ibeR、ibeA、ibeT。其中,ibeA基因的功能已得到初步研究,它在E.coli K1侵襲HBMECs中起作用；其余14個基因的功能尚不清楚。GimA中推斷的各基因編碼蛋白

6、與目前GeneBank庫中功能已知蛋白之間的同源性高低程度分析結(jié)果提示:GimA1中ptnI與磷酸烯醇型丙酮酸磷酸化轉(zhuǎn)移酶有很高的同源性；GimA2中cglD與甘油脫氫酶的同源性為62％；GimA3中g(shù)cxC與乙醛酸-醛連接酶的同源性高達67％；GimA4中含有E.coli K1侵襲HBMECs有關(guān)的ibeA,而其中的兩個基因ibeT和ibeR尚未發(fā)現(xiàn)與其他蛋白有較高的同源性,鑒于這兩個基因與ibeA同處于一個操縱子,故提示可能參與E.

7、coli K1侵襲HBMECs。探討這些基因在E.coli K1致腦膜炎中的作用,可以使我們更好的了解大腸桿菌性腦膜炎的發(fā)病機制。因此,我們選取了GimA2中的cglD基因和GimA4中的ibeT基因作為研究對象,展開了本工作。
　　 圖1,E.coli K1 GimA毒力島基因定位和組成圖譜
　　 方 法
　　 一、大腸桿菌毒力島基因cglD的功能研究
　　 (一)細(xì)菌培養(yǎng)
　　 大腸桿菌以LB

8、培養(yǎng)基培養(yǎng),在行細(xì)胞侵襲試驗前,用含有利福平的BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)E44。
　　 (二)細(xì)胞培養(yǎng)
　　 HBMECs于含有10％FBS、10％Nu血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,于37℃、5％CO2、100％濕度的條件下培養(yǎng)。
　　 (三)E44:△cglD基因缺失突變株的構(gòu)建
　　 將攜帶打靶基因兩側(cè)DNA片段的自殺性質(zhì)粒pCVD442通過細(xì)菌間的接合傳遞到E44中,利用菌體內(nèi)同源交換,從E44中剔除cg

9、lD基因。
　　 (四)互補實驗
　　 將cglD基因的ORF克隆到質(zhì)粒pFN476上,將其與pGP1-2共同轉(zhuǎn)化給E44:△cglD。
　　 (五)細(xì)菌黏附和侵襲試驗
　　 1、細(xì)菌黏附試驗
　　 向HBMECs單層加入1x107個過夜培養(yǎng)的大腸桿菌,作用1.5h后,收集細(xì)胞內(nèi)外的細(xì)菌,結(jié)果用相對黏附力表示；
　　 2、細(xì)菌侵襲試驗
　　 向HBMECs單層加入1×107個過夜培

10、養(yǎng)的大腸桿菌,作用1.5h后,殺死細(xì)胞外的細(xì)菌,收集細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌,結(jié)果用相對侵襲力表示。
　　 (六)半數(shù)致死量和生存分析
　　 Bliss法計算大腸桿菌對新生鼠的半數(shù)致死量；Kaplan-Meier方法繪制生存曲線。
　　 (七)新生大鼠實驗性細(xì)菌性腦膜炎模型的建立
　　 皮下注射一定濃度的細(xì)菌,建立新生大鼠菌血癥模型,腦膜炎模型由血行播散而致。
　　 (八)腦脊液白細(xì)胞計數(shù)及蛋白和乳酸含量的測

11、定
　　 血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)腦脊液白細(xì)胞,BCA蛋白定量法測定腦脊液蛋白含量,乳酸脫氫酶比色法測定腦脊液乳酸含量。
　　 (九)組織病理學(xué)分析
　　 新生大鼠腦切片經(jīng)HE染色后,顯微鏡觀察腦膜以及大腦皮層區(qū)中性粒細(xì)胞的浸潤。
　　 (十)人多形核白細(xì)胞(PMNs)跨內(nèi)皮遷移實驗
　　 從人新鮮的外周血中分離PMNs,計數(shù)經(jīng)大腸桿菌趨化后穿過HBMECs單層的PMNs。
　　 (十一)重組蛋白

12、的表達和純化
　　 利用BL21(DE3)表達含有cglD基因的重組質(zhì)粒,用親和層析法純化融合蛋白。
　　 (十二)甘油脫氫酶活性分析
　　 比色法測定菌體裂解液和純化蛋白的甘油脫氫酶活性。
　　 二、大腸桿菌毒力島基因ibeT的功能研究
　　 (一)細(xì)菌培養(yǎng)
　　 大腸桿菌以LB培養(yǎng)基培養(yǎng),在行細(xì)胞侵襲試驗前,用含有利福平的BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)E44。
　　 (二)細(xì)胞培養(yǎng)
　

13、　 HBMECs于含有10％FBS、10％Nu血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,于37℃、5％CO2、100％濕度的條件下培養(yǎng)。
　　 (三)E44:△ibeT基因缺失突變株的構(gòu)建
　　 將攜帶打靶基因兩側(cè)DNA片段的自殺性質(zhì)粒pCVD442通過細(xì)菌間的接合傳遞到E44中,利用菌體內(nèi)同源交換,從E44中剔除ibeT基因。
　　 (四)互補實驗
　　 將ibeT基因的ORF克隆到質(zhì)粒pFN476上,將其與

14、pGP1-2共同轉(zhuǎn)化給E44:ΔibeT。
　　 (五)細(xì)菌黏附和侵襲試驗
　　 1、細(xì)菌黏附試驗
　　 向HBMECs單層加入1×107個過夜培養(yǎng)的大腸桿菌,作用1.5h后,收集細(xì)胞內(nèi)外的細(xì)菌,結(jié)果用相對黏附力表示；
　　 2、細(xì)菌侵襲試驗
　　 向HBMECs單層加入1×107個過夜培養(yǎng)的大腸桿菌,作用1.5h后,殺死細(xì)胞外的細(xì)菌,收集細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌,結(jié)果用相對侵襲力表示。
　　 (六)

15、細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)存活試驗
　　 向HBMECs單層加入1×107個過夜培養(yǎng)的大腸桿菌,作用1.5h后,殺死細(xì)胞外的細(xì)菌,在繼續(xù)培養(yǎng)指定時間收集細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌,結(jié)果用菌落數(shù)表示。
　　 (七)細(xì)菌生長曲線測定
　　 將細(xì)菌接種于一定體積的培養(yǎng)基中培養(yǎng),測定大腸桿菌在不同時間點波長為600 nm時的吸光度值,繪制生長曲線。
　　 (八)免疫熒光實驗
　　 激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察。
　　 (九)

16、透射電鏡觀察
　　 利用超薄切片機將包埋塊切成70～80nm的超薄切片,經(jīng)染色后,利用透射電子顯微鏡觀察。
　　 (十)細(xì)菌緩沖容量測定
　　 通過測定細(xì)菌胞內(nèi)和胞外總的緩沖容量和細(xì)菌胞外緩沖容量,計算得到細(xì)菌胞內(nèi)緩沖容量。
　　 結(jié) 果
　　 一、大腸桿菌毒力島基因cglD在實驗性新生兒腦膜炎中的作用
　　 1、E.coli K1等位基因cglD缺失突變株的構(gòu)建
　　 2、cgl

17、D基因缺失延長腦膜炎模型鼠的存活時間,但并不影響E.coliK1穿過血腦屏障
　　 3、cglD基因的缺失減輕了腦膜炎模型鼠腦脊液的改變
　　 4、cglD基因的缺失減輕了腦膜炎模型鼠腦膜和腦皮質(zhì)區(qū)中性粒細(xì)胞的浸潤
　　 5、CglD蛋白具有甘油脫氫酶的活性
　　 二、毒力島基因ibeT有助于大腸桿菌抵抗人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞溶酶體的降解
　　 1、E.coli K1等位基因ibeT缺失突變株的構(gòu)建<

18、br>　　 2、E.coli K1 ibeT基因缺失影響E.coli K1侵襲HBMECs
　　 3、ibeT基因缺失抑制了E.coli K1在HBMECs中的生長
　　 4、ibeT基因缺失導(dǎo)致E.coli K1逃逸HBMECs溶酶體的能力發(fā)生缺陷
　　 5、ibeT基因有利于E.coli K1從ECV中逃逸入細(xì)胞漿
　　 6、敲除ibeT基因后的E44:ΔibeT突變株菌體胞內(nèi)的緩沖容量下降