腦膜炎大腸桿菌K1株新基因cglE的克隆、表達及功能研究.pdf

1、細菌性腦膜炎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervesystem，CNS)最常見最嚴(yán)重的感染性疾病。盡管抗生素的廣泛使用，但細菌性腦膜炎的發(fā)病率仍有5％-40％，而幸存者神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率高達30％。細菌性腦膜炎的高感染率和死亡率的主要原因之一是由于其發(fā)病機制還不清楚。 大腸桿菌(EscherichiacoliE.coli)是導(dǎo)致新生兒腦膜炎最常見的革蘭氏陰性桿菌。已知大部分發(fā)生在新生兒中的細菌性腦膜炎是細菌血源性傳播的結(jié)果

2、。進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是細菌性腦膜炎發(fā)生的必要條件，但關(guān)于血循環(huán)中的大腸桿菌如何穿透由腦微血管內(nèi)皮細胞(brainmicrovascularendothelialcells，BMECs)等組成的血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB)，其機制仍待研究。目前在腦膜炎大腸桿菌感染組學(xué)的研究中，已經(jīng)確定部分基因與細菌穿透血腦屏障有關(guān)。通過TnphoA突變實驗發(fā)現(xiàn)基因ibeA在細菌侵襲BMEC過程中發(fā)揮著重要作用，且為毒力株E.co

3、liK1株所獨有的。包含著ibeA的基因島命名為GimA(aGeneticislandofmeningiticE.colicontainingibeA)。GimA全長20.3kb，其GC含量(46.2％)與Ecoli基因組的GC含量(50.8％)不同，含有4個操縱子，分別是ptnIPKC,cglDTEC，gcxKRCI和ibeRAT，共15個基因。該基因島是由美國南加州大學(xué)醫(yī)學(xué)院洛杉磯兒童醫(yī)院黃勝和教授發(fā)現(xiàn)并命名，通過信息學(xué)預(yù)測該基因島

4、編碼10個參與代謝通路的酶，3個轉(zhuǎn)運蛋白，1個調(diào)節(jié)蛋白和1個侵襲素(IbeA)。其中對細菌穿透血腦屏障起關(guān)鍵作用的ibeA基因已為黃教授及本實驗室研究報道。在其它14個新基因中，位于第二個操縱子cglDTEC(GimA2)上的第三個基因為cglE，有文獻報道它與很多物種的二氫硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamidedehydrogenase，DLDH)有同源性。為了進一步闡明新基因cglE的功能，我們克隆和表達了該基因編碼產(chǎn)物，

5、并通過相關(guān)軟件及數(shù)據(jù)庫對其進行分析預(yù)測，并用實驗方法對其功能進行初步驗證。 首先通過生物信息學(xué)分析CglE的生物學(xué)功能發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有Pyr、FAD、Lpd、NADH等結(jié)構(gòu)域，而這些結(jié)構(gòu)域是很多物種的二氫硫辛酸脫氫酶(DLDH)共有的。隨后對CglE與其它六個菌株來源的DLDH進行蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，CglE與它們有較高同源性，尤其是在N端。另外我們還發(fā)現(xiàn)CglE與IbeA蛋白序列的同源性達50％，用DNASTAR分析其的二級結(jié)構(gòu)

6、發(fā)現(xiàn)這兩個蛋白的親水疏水基團、表面可及性都很接近。這些預(yù)測為我們功能研究提供方向。 隨后我們對cglE進行克隆表達獲得純化的CglE蛋白。設(shè)計合成引物，利用PCR的方法從文庫質(zhì)粒中擴增出cglE片段，并連接于T載體上；雙酶切法獲得cglE片段，連接于經(jīng)同樣酶切的表達載體pET22b(+)。重組表達載體鑒定正確后開始蛋白表達，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示CglE蛋白是一分子量約為50,000Dalton的蛋白，與軟件預(yù)測一致。利用

7、Western-blot的方法，用抗His單克隆抗體驗證表達的蛋白為目的蛋白。通過對表達條件進行優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)在細菌培養(yǎng)到OD600=0.6時開始對蛋白進行誘導(dǎo)，添加IPTG終濃度為1mmol/L，27℃誘導(dǎo)4hr后蛋白表達產(chǎn)量最高。通過對蛋白可溶性分析，發(fā)現(xiàn)目的蛋白基本以包涵體形式存在于沉淀中。對包涵體洗滌后用8mol/L尿素進行溶解，嘗試幾種不同的復(fù)性方法，最后采用稀釋復(fù)性的方法，并在復(fù)性液中添加甘油，使變性的蛋白得以復(fù)性并保持穩(wěn)定

8、性。經(jīng)過His·Bind親和層析方法獲得純化的CglE蛋白，試劑盒測定其濃度為0.458mg/ml。 純化的蛋白首先用于硫辛酰氨脫氫酶的酶活性測定。利用還原型輔酶Ⅰ(NADH)在340nm處有強吸收峰，用分光光度法測量NADH在340nm處吸光度，可指示出酶反應(yīng)的進程改變，初步判斷反應(yīng)是否進行，進而說明是否具有酶活性。本實驗以商品化的硫辛酰氨脫氫酶為陽性對照，確定酶反應(yīng)的體系；以與CglE有較高同源性的IbeA為陰性對照，分別測

9、定NADH在340nm處吸光度。以時間(min)為橫坐標(biāo)，A340為縱坐標(biāo)繪制圖標(biāo)，結(jié)果顯示添加了CglE能使NADH在340處的吸光度逐漸下降，而添加IbeA則無此變化，提示CglE具有二氫硫辛酰氨脫氫酶的活性。 通過Western-blot方法對CglE蛋白抗原性分析發(fā)現(xiàn)，CglE能與IbeA的多克隆抗體結(jié)合，提示它們擁有相似的抗原決定族。另外我們用FarWestern-blot的方法發(fā)現(xiàn)CglE能與IbeA結(jié)合蛋白(IBP

10、50v)結(jié)合。有研究表明IbeA是通過配體受體間的結(jié)合而激活信號傳導(dǎo)通路從而輔助細菌穿透血腦屏障，利用噬菌體肽庫所篩選出來的HP-12短肽即是IbeA結(jié)合肽。我們通過ELISA實驗發(fā)現(xiàn)這個結(jié)合肽也能與CglE特異性結(jié)合，提示CglE很可能與IbeA有共同的受體，它們可能通過同一條信號傳導(dǎo)通路作用于細菌的侵襲活動。 關(guān)于CglE在細菌侵襲腦微血管內(nèi)皮細胞中所起的作用，仍需要通過研究缺失cglE的突變菌株的毒力來說明。利用SOE的P