VEGF在Lewis肺癌微轉(zhuǎn)移灶形成中的作用及機制研究.pdf

1、肺癌是常見惡性腫瘤之一,嚴(yán)重著威脅人類的健康.早期診斷肺癌轉(zhuǎn)移,尤其是肺癌亞臨床轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移(micrometastasis),對于提高肺癌的治愈率和生存率至關(guān)重要.目前有關(guān)肺癌微轉(zhuǎn)移機理的研究日益受到重視,良好的實驗?zāi)Ｐ褪菧?zhǔn)確揭示癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移生長特性,進而闡明其機理的基礎(chǔ).綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)性能穩(wěn)定的分子,己經(jīng)在多種細(xì)胞中獲得表達,用于定位蛋白及示蹤

2、細(xì)胞等研究.腫瘤血管生成及侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 (Vascular endothelial growth factor ,VEGF)是重要的血管生成因子,在人體多數(shù)細(xì)胞均有表達,通過其受體FLT和KDR誘導(dǎo)新生血管形成.sFLT是其可溶性受體,為VEGF功能抑制劑.近年來研究發(fā)現(xiàn),VEGF在許多實體瘤中過量表達,與腫瘤血管生成、生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān).但VEGF與腫瘤微轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未見報道.腫瘤轉(zhuǎn)移是一系列復(fù)雜的事

3、件,突破基底膜是腫瘤細(xì)胞進行浸潤和轉(zhuǎn)移的最初和最關(guān)鍵階段,細(xì)胞外基質(zhì)的降解是突破基底膜的必須環(huán)節(jié).基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)(matrix metalloproteinase,MMP)是組織基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的主降解者,因而MMP在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,其中以基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9(MMP-2、9)的作用尤為重要.近來對血液性腫瘤和卵巢癌組織和等研究表明,VEGF可通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞MMP-2、9的表達,繼而促進腫瘤侵襲.VEGF在肺癌中有

4、無此作用尚未見報道.該研究并以Lewis肺癌細(xì)胞(lewis lung carcinoma,LLC)為研究對象,利用基因克隆技術(shù),構(gòu)建綠色熒光蛋白標(biāo)記的含鼠VEGF或sFLT全長序列的真核雙表達載體,用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移Lewis肺癌細(xì)胞株,觀察轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞系對細(xì)胞生長、血管生成能力及基底膜侵襲能力的改變,并檢測VEGF對金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9表達的影響;將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于C57BL/6J純系小鼠,復(fù)制實驗性和自發(fā)性微轉(zhuǎn)移

5、模型,觀察VEGF對微轉(zhuǎn)移形成的影響和相關(guān)因子表達的變化.最后還進一步從臨床觀察肺癌患者血清VEGF的水平與微轉(zhuǎn)移的關(guān)系.主要結(jié)果如下:1. 以綠色熒光蛋白為報告基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠lewis肺癌細(xì)胞,利用腫瘤細(xì)胞侵襲實驗、RT-PCR 、Westernblot等技術(shù),觀察轉(zhuǎn)染后VEGF和sFLT在體外對lewis肺癌細(xì)胞株(LLC)侵襲和血管生成能力的影響.發(fā)現(xiàn):1)利用基因克隆技術(shù),成功構(gòu)建了pEGFP-VEGF和pEGFP-s

6、FLT真核雙表達載體,并將兩表達載體及pEGFP空載體轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞,并分別命名為LLC-VEGF、 LLC-sFLT 和LLC-mock,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在體外均能穩(wěn)定表達綠色熒光.檢測轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn),VEGF及sFLT在體外對腫瘤細(xì)胞的生長無影響,提示VEGF可能是通過旁分泌途徑作用于腫瘤細(xì)胞.2)腫瘤的轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成及侵襲密切相關(guān).血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附并向腫瘤移行才能實現(xiàn)腫瘤的血管生成.采用侵襲小室將腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)

7、胞ECV304共培養(yǎng),模擬體內(nèi)癌細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用.結(jié)果發(fā)現(xiàn), LLC-mock 組、LLC-VEGF組和LLC-sFLT組遷移到膜背面的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)分別是32±7.23個、97±10.26個和10±1.35個.即LLC-VEGF中過表達的VEGF能促進共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞穿過基質(zhì),LLC-sFLT中高表達的sFLT能抑制共培養(yǎng)ECV304的遷移.在腫瘤細(xì)胞侵襲實驗中,LLC-mock 組、LLC-VEGF組和LLC-sFLT組穿膜

8、的細(xì)胞數(shù)分別為34±2.45個、75±15.11個和15±1.41個,統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著性差異(P<0.05).表明VEGF能促進腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,sFLT能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力.上述結(jié)果提示VEGF均能增強腫瘤的血管生成能力及侵襲能力.3)MMP-2和MMP-9是主要的腫瘤侵襲因子,RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),VEGF可對其表達在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平都有上調(diào)作用,而sFLT可特異性抑制VEGF的作用.由此可見

9、,VEGF可能是通過激活MMP-2、MMP-9的表達促進腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,sFLT則通過阻斷VEGF的功能,從而抑制MMP-2、MMP-9的表達,降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力.4)MMP-2、9以酶原形式分泌入細(xì)胞外基質(zhì),激活后才能發(fā)揮作用.利用明膠酶譜分析法檢測MMP-2、9的活性時發(fā)現(xiàn),與LLC-mock組相比,LLC-VEGF組MMP-2和MMP-9的含量均較高,而LLC-sFLT組較低(P<0.05).且MMP-2的含量較MMP-9

10、高 (P<0.01).提示VEGF能增強MMP-2、9的活化,sFLT特異性地阻斷這一效應(yīng).結(jié)果還顯示,腫瘤細(xì)胞以活化MMP-2為主,提示MMP-2可能在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起更為重要的作用.2. 采用小鼠成瘤實驗,復(fù)制綠色熒光蛋白標(biāo)記的實驗性和自發(fā)性微轉(zhuǎn)移模型,利用免疫組化、RT-PCR 和Western blot等技術(shù),在體研究VEGF和sFLT對Lewis肺癌微轉(zhuǎn)移灶形成及相關(guān)因子表達的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)實驗性和自發(fā)性微轉(zhuǎn)移模型分別在

11、第2天和1周后檢測到肺內(nèi)綠色熒光蛋白示蹤的微轉(zhuǎn)移灶.實驗性微轉(zhuǎn)移灶在接種后第2、4、7天的平均直徑分別為20μm、40μm和100μm,到接種后10天,平均直徑迅速增大到500μm.2)在Lewis肺癌實驗性和自發(fā)性微轉(zhuǎn)移形成中,與LLC-mock組相比,LLC-VEGF組能明顯增加微轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目和大小,LLC-sFLT組則顯著抑制微轉(zhuǎn)移灶的形成.提示VEGF能顯著促進LLC-VEGF腫瘤細(xì)胞在肺內(nèi)微轉(zhuǎn)移灶的形成,sFLT能明顯抑制LL

12、C-sFLT腫瘤細(xì)胞在肺內(nèi)種植.3)在自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型中,與LLC-mock移植瘤相比,LLC-VEGF組小鼠移植瘤微血管密度(MVD)顯著增加.LLC-sFLT移植瘤的MVD比前兩組都顯著降低.提示VEGF能促進小鼠移植瘤的血管生成,sFLT則抑制小鼠移植瘤的血管生成.4)在自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型中,通過RT-PCR分析小鼠移植瘤組織中MMP-2、9的表達時發(fā)現(xiàn),LLC-VEGF中高表達的VEGF能抑制MMP-2、 9的表達.LLC-sFLT則

13、抑制MMP-2、9的表達;Western blot 檢測蛋白水平變化得到相似的結(jié)果.對MMP-2、9的免疫組化染色結(jié)果也顯示,LLC-VEGF小鼠移植瘤組織中MMP-2、9呈強陽性,LLC-sFLT小鼠移植瘤組織中該二因子呈弱陽性.說明高表達的VEGF促進移植瘤中MMP-2、MMP-9的表達,高表達的sFLT則抑制MMP-2、MMP-9的表達.5)在實驗性轉(zhuǎn)移模型和自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型中,隨微轉(zhuǎn)移灶的不斷形成,血清VEGF的表達水平逐步升高(

14、P<0.05).兩種轉(zhuǎn)移模型組間比較發(fā)現(xiàn),LLC-VEGF細(xì)胞組中血清VEGF表達水平較其它兩組高.將血清VEGF的表達與實驗性轉(zhuǎn)移模型中肺部微轉(zhuǎn)移灶的大小進行相關(guān)性分析顯示,兩者呈正相關(guān)(r=0.9857, P<0.05).提示血清中VEGF的表達水平可以反映肺內(nèi)微轉(zhuǎn)移的情況.3. 采用免疫酶聯(lián)技術(shù)和RT-PCR,分別檢測130例臨床非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者血清VEGF水平及外周血微轉(zhuǎn)移標(biāo)志物CK19mRNA的陽性率.分析血清V

15、EGF水平與NSCLC微轉(zhuǎn)移的關(guān)系.發(fā)現(xiàn):1)血清VEGF的水平在Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期隨著臨床分期的遞增逐步升高(P<0.01).外周血CK19mRNA陽性率的檢測有類似結(jié)果.2)VEGF的表達水平與CK19陽性率顯著相關(guān).CK19陽性者VEGF的表達顯著增加.提示VEGF與肺癌的微轉(zhuǎn)移相關(guān).3)外周血CK19mRNA與血清VEGF能反映的肺癌轉(zhuǎn)移情況.總之,該課題從體外侵襲與促血管形成能力的研究及在體內(nèi)鼠微轉(zhuǎn)移灶形成與相關(guān)因子的研究及

16、臨床肺癌患者血清VEGF水平的分析三個方面,闡述了VEGF促肺癌微轉(zhuǎn)移形成的作用及其機制.結(jié)果表明VEGF能促進Lewis肺癌微轉(zhuǎn)移灶的形成,其機制主要通過兩條途徑:一是作用血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致腫瘤血管生成,間接促進腫瘤微轉(zhuǎn)移形成、發(fā)展;二是直接作用于腫瘤細(xì)胞,上調(diào)腫瘤細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達及活化,增強腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,使腫瘤細(xì)胞通過溶解基底膜入血轉(zhuǎn)移.并證明EGFP基因轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞在體內(nèi)、外可穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白,是腫瘤轉(zhuǎn)移