S100B在肺癌腦轉(zhuǎn)移患者血清中含量檢測及相關(guān)轉(zhuǎn)移機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率具有明顯逐年上升的趨勢，已成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。肺癌約20％-50％會發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，隨著肺癌綜合治療的進(jìn)展，患者生存期的延長以及檢查方法的改進(jìn)，肺癌腦轉(zhuǎn)移的診斷率逐漸增高。其中腺癌的腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率最高，其次為小細(xì)胞肺癌。腦轉(zhuǎn)移是肺癌死亡相關(guān)的重要病因，自然生存期僅為1-2月。在臨床治療中，對于肺癌腦轉(zhuǎn)移的治療方法如手術(shù)、放療、化療等均在不斷改進(jìn)，但是治療效果仍不

2、盡人意，究其主要原因是目前對肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制仍然不清楚。因此，進(jìn)一步研究并完善肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的有效的治療靶點(diǎn)，才有望提高治療療效，延長患者的生存期。
　　腦部是一個由獨(dú)特的細(xì)胞和周圍血腦屏障組成，缺乏淋巴引流的高度特殊的環(huán)境。據(jù)Paget，s經(jīng)典“種子與土壤”假說，成功的腦轉(zhuǎn)移取決于腫瘤細(xì)胞與腦微環(huán)境二者的相互關(guān)系，涉及一系列分子的生物學(xué)功能。然而，腦轉(zhuǎn)移的發(fā)展機(jī)制與相關(guān)分子目前仍知之甚少。
　　我們實(shí)

3、驗(yàn)室前期篩選出了高潛力腦轉(zhuǎn)移肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C14/B，并發(fā)現(xiàn)S100B蛋白在此細(xì)胞中高表達(dá)，而在低潛力腦轉(zhuǎn)移肺腺癌PC14細(xì)胞為低表達(dá)。由此推測，S100B可能與肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　本課題受2009年國家自然科學(xué)基金資助（項(xiàng)目名稱：S100B在肺癌腦轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制研究項(xiàng)目編號：30973488），我們前期應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)了PC14/B中S100B，并對其生物學(xué)改變和對肺癌腦轉(zhuǎn)移的影響進(jìn)行了初步研究。
　

4、　目標(biāo)：
　　本研究的目標(biāo)是深入了解S100B在肺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中的作用與機(jī)制，通過將S100B轉(zhuǎn)染至低潛力腦轉(zhuǎn)移肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C14，探討S100B對PC14細(xì)胞的生長增殖、遷移侵襲能力的影響及其初步的作用機(jī)制，揭示S100B在肺癌腦轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的生物學(xué)功能，為深入研究肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生過程及分子機(jī)制提供新的思路。
　　研究方法：
　?。?）收集臨床腦轉(zhuǎn)移和未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者血清，應(yīng)用ELISA方法檢測血清S10

5、0B的含量，分析肺癌腦轉(zhuǎn)移與血清S100B含量的關(guān)系；
　?。?）構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-S100B，應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染載體至PC14細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，通過RT-PCR、Westernblot的方法鑒定轉(zhuǎn)染效率；
　　（3）通過MTT比色法測定PC14/S100B與其對照組PC14細(xì)胞的OD值，繪制細(xì)胞生長曲線，比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的增殖能力變化；
　　（4）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測PC14/S100B與

6、其對照組PC14細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化；
　?。?）通過Transwell侵襲小室檢測PC14/S100B與其對照組PC14細(xì)胞的遷移和侵襲能力的變化；
　?。?）初步探討S100B在促PC14細(xì)胞遷移和侵襲中的作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　?。?）血清S100B含量在肺癌腦轉(zhuǎn)移者較未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移者高，含量別為0.048μg/l和0.015μg/l（P＜0.01）；
　　（2）經(jīng)RT-PCR、West

7、ernblot鑒定轉(zhuǎn)染效率，G418篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株克隆PC14/S100B；
　?。?）通過MTT比色法，PC14/S100B細(xì)胞較其對照組PC14細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；
　?。?）PC14/S100B細(xì)胞較其對照組PC14細(xì)胞遷移和侵襲能力均增強(qiáng)，Transwell小室結(jié)果分別為83.4±5.6vs53.2±3.9和53.4±4.7vs31.2±3.0（P＜0.01）；
　　（5）應(yīng)用流式細(xì)胞儀監(jiān)測發(fā)現(xiàn)PC14/S1

8、00B細(xì)胞較其對照組PC14細(xì)胞凋亡受到抑制，凋亡抑制率分別為3.40±0.44％和10.90±0.67％（P＜0.05），PC14/S100B細(xì)胞的細(xì)胞周期出現(xiàn)了G1→S期的過渡；
　?。?）較其對照組PC14細(xì)胞，PC14/S100B細(xì)胞侵襲偽足明顯伸長，細(xì)胞形態(tài)由圓形向梭形改變；Westernblot結(jié)果顯示IQGAP1的表達(dá)較其對照組PC14細(xì)胞明顯升高（IOD值117.64vs20.569）。
　　結(jié)論
　　

9、前期的研究發(fā)現(xiàn)S100B蛋白與肺癌腦轉(zhuǎn)移相關(guān)，本研究我們在細(xì)胞、蛋白以及基因水平探索了S100B在肺癌腦轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。
　　臨床收集的血清標(biāo)本經(jīng)過ELISA檢測S100B含量，結(jié)果顯示為肺癌腦轉(zhuǎn)移患者較未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移其含量明顯升高，這一結(jié)果提示S100B在肺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，可能在患者的診斷中有著重要意義；其次，轉(zhuǎn)染S100B的PC14細(xì)胞增殖能力提高，凋亡減少，表明S100B的促增殖抗凋亡的作用，同時G1期細(xì)胞比例下

10、降，S期的比例增加，這些結(jié)果進(jìn)一步說明，S100B蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，加速從G1期向S期的過渡。所以我們認(rèn)為增殖能力提高、凋亡減少都是肺癌腦轉(zhuǎn)移的“種子”的優(yōu)良“先天條件”；第三，Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染S100B后的PC14細(xì)胞形態(tài)由圓形向梭形改變，并出現(xiàn)侵襲性偽足，同時遷移和侵襲能力均明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步的Westernblot結(jié)果顯示其支架蛋白IQGAP1的表達(dá)量增多，IQGAP1正是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲性偽足的產(chǎn)生及運(yùn)動