胚胎干細胞在Lewis肺癌中的體內(nèi)外抗腫瘤作用研究.pdf

1、肺癌是當今世界對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，盡管采取一系列綜合治療手段，肺癌患者的生存率依然沒有得到明顯提高，據(jù)統(tǒng)計，肺癌患者總的1年生存率低于30％，5年生存率低于16％。目前在臨床上廣泛采用的傳統(tǒng)治療方式如外科治療、化療和放療等治療效果不理想，即使近年來迅速發(fā)展的分子靶向治療和個體化治療等效果也不盡如人意，研究顯示導致這種結(jié)果的主要原因是由于肺癌的遠處轉(zhuǎn)移和治療后的局部復發(fā)，因此如果能發(fā)現(xiàn)一種既具有直接殺傷腫瘤作用，又能夠提高

2、患者機體免疫功能、消滅循環(huán)系統(tǒng)微轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的治療方法或藥物，無疑是肺癌患者的福音，而這些特點恰恰是腫瘤免疫治療的優(yōu)點所在。
　　 從免疫學角度而言，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是腫瘤與機體免疫系統(tǒng)之間相互作用的結(jié)果，機體的免疫系統(tǒng)是體內(nèi)一個功能強大而復雜的調(diào)控和執(zhí)行網(wǎng)絡，正常情況下具有明確抗原性的腫瘤細胞能被免疫識別并清除，然而腫瘤細胞通過在功能和結(jié)構(gòu)方面發(fā)生一系列變化，使其能夠逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷作用。例如，腫瘤細胞通過改變其表

3、面抗原的表達，使其免疫原性減弱，從而導致機體無法對其產(chǎn)生特異性的免疫應答;腫瘤細胞表面MHC分子缺失、表達下調(diào)或變異，導致抗原呈遞過程障礙，從而不能被細胞毒性淋巴T細胞(CTL)識別并進一步影響腫瘤細胞的體內(nèi)清除;多數(shù)腫瘤細胞協(xié)同刺激分子表達異常，導致細胞免疫中缺乏協(xié)同作用的第二信號傳遞，從而逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊;腫瘤負荷引起體內(nèi)的樹突狀細胞(DC)功能缺陷，因而抗原呈遞能力變差，無法正常激活初始T細胞造成腫瘤的免疫耐受等;并且多數(shù)腫

4、瘤細胞在體內(nèi)能分泌多種免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、唾液酸粘蛋白(sialomucin)和巨噬細胞遷移抑制因子(macrophagemigration inhibitory factor，MIF)等，抑制體內(nèi)T細胞分化和分泌功能，破壞Th1/Th2細胞因子的平衡狀

5、態(tài)，從而有利于腫瘤細胞在體內(nèi)的生長和增殖。在腫瘤免疫治療的臨床實踐中人們發(fā)現(xiàn)，正是由于腫瘤細胞表面抗原分子表達的改變、腫瘤本身對機體的免疫抑制作用以及腫瘤細胞免疫逃逸的存在使其表面標記和抗原能夠逃脫機體的免疫監(jiān)視，因而難以引發(fā)有效的免疫應答。
　　 人們經(jīng)多年的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞與胚胎干細胞在很多重要的生物學行為方面都有著非常驚人的相似性，例如兩者均具有快速增殖和分化能力、侵襲能力，并且能夠在一定程度上逃逸機體的免疫監(jiān)視，都在細胞

6、表面表達類似的細胞因子，細胞內(nèi)或核內(nèi)具有許多共同的分子信號轉(zhuǎn)導通路，并且在基因和蛋白水平共有很多相似的表達產(chǎn)物，尤為重要的是兩者共同具有區(qū)別于成熟體細胞的、類似的細胞表面標記/表面抗原。研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞及其衍生細胞來源的抗原，能夠在體內(nèi)有效激活CD4+和CD8+的T淋巴細胞，并且有研究證實，胚胎干細胞表面的MHC-Ⅰ類分子和其他蛋白抗原可以在體內(nèi)誘發(fā)T淋巴細胞介導的、細胞毒性淋巴細胞作為效應細胞的的免疫反應。
　　 我們認為這

7、種機體由于接種胚胎干細胞后誘導產(chǎn)生的穩(wěn)定而持久的免疫反應，因為表面抗原的類似，可以交叉作用于腫瘤細胞，從而使機體具備了有效的抗腫瘤免疫，這為腫瘤的免疫治療打開了新的思路。盡管當時機制尚不明了，德國學者Sch(o)ne等曾研究指出，嚙齒類動物經(jīng)接種早期胚胎組織可以明顯抑制移植性腫瘤的生長。此后，經(jīng)過一系列研究人們發(fā)現(xiàn)這樣的現(xiàn)象，接種早期胚胎組織不僅可以抑制動物體內(nèi)移植性腫瘤的生長，還可以預防由于物理、化學等致癌因素導致的腫瘤發(fā)生，這種抗腫

8、瘤免疫作用對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均具有明顯的抑制作用。而且最近的研究顯示，這種胚胎組織/胚胎干細胞誘導的抗腫瘤免疫效應具有廣譜的抗腫瘤作用，可能對多種腫瘤均具有顯著的抑制作用;并且，這種作用被證實并不是一種機體針對外來異物發(fā)生的“異物反應”，人們推測其可能是由多種效應細胞和細胞因子參與構(gòu)成的針對胚胎干細胞表面抗原的特異性免疫應答。
　　 在另一方面，胚胎干細胞抗腫瘤作用的體外研究也取得了一系列令人驚喜的研究成果。例如，Raof和Po

9、stovit等的研究顯示胚胎干細胞的生長微環(huán)境具有誘導腫瘤細胞重新編程和良性轉(zhuǎn)化的作用，并且能夠在一定程度上抑制體內(nèi)局部腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移瘤的出現(xiàn);Giuffrida等研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細胞在體外環(huán)境中能夠分泌一些可溶性的抗腫瘤因子，具有抑制多種腫瘤細胞的生長的作用，并且能夠阻滯腫瘤細胞的細胞周期;Lee等證實胚胎干細胞微環(huán)境能夠改變腫瘤細胞的生長方式，誘導惡性腫瘤獲得一定的良性表型，從而具有抗腫瘤作用;Kulesa等研究發(fā)現(xiàn)，胚胎神經(jīng)嵴發(fā)

10、育微環(huán)境能夠使高轉(zhuǎn)移黑色素瘤向正常表型轉(zhuǎn)化，惡性程度降低并表現(xiàn)為其起源細胞的細胞學形狀;最近的研究結(jié)果表明，胚胎干細胞能在體外環(huán)境中誘導分化成為具有激發(fā)機體抗腫瘤免疫作用的抗原呈遞細胞-樹突狀細胞，或者分化成為具有直接殺傷腫瘤細胞作用的免疫效應細胞，例如自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)、單核細胞和粒細胞等。
　　 本課題在總結(jié)前人研究工作經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，從體外和體內(nèi)兩方面深入研究胚胎干細胞在Lewis肺

11、癌中的抗腫瘤作用，并在整體、細胞和分子水平探索其抗腫瘤作用的具體作用機制:在體外研究中，通過建立胚胎干細胞-Lewis肺癌細胞體外非接觸式Transwell共培養(yǎng)體系，更直觀、更直接地觀察和檢測胚胎干細胞/胚胎干細胞微環(huán)境對腫瘤細胞的抑制作用，研究共培養(yǎng)條件下Lewis肺癌細胞的重要生物學行為改變，主要包括細胞周期、細胞凋亡和腫瘤細胞遷移、侵襲能力特別是其成瘤能力等重要生物學行為的變化;在體內(nèi)研究中，通過構(gòu)建Lewis肺癌小鼠動物模型并

12、模擬腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段，分別研究胚胎干細胞在預防移植性腫瘤的發(fā)生及腫瘤進展中的治療作用兩方面的相關(guān)作用機制，并從整體水平、效應細胞、細胞因子和腫瘤組織局部病理變化等多個方面探索胚胎干細胞在體內(nèi)誘導抗腫瘤免疫過程中可能的作用機制和途徑，為肺癌的免疫治療和胚胎干細胞抗腫瘤作用研究開辟新的研究領(lǐng)域，為肺癌的預防及治療帶來新的希望。
　　 第一部分胚胎干細胞抗Lewis肺癌作用的體外研究
　　 第一節(jié)胚胎干細胞對Lewis肺

13、癌細胞體外增殖的抑制作用
　　 研究目的:
　　 研究胚胎干細胞在體外細胞共培養(yǎng)條件下對Lewis肺癌細胞的抑制作用，探索胚胎干細胞體外抗腫瘤作用機制。
　　 研究方法:
　　 通過建立C57/BL6小鼠胚胎干細胞-Lewis肺癌細胞體外Transwell非接觸式共培養(yǎng)體系，研究共培養(yǎng)條件下Lewis肺癌細胞的重要生物學行為改變，主要包括細胞周期、細胞凋亡，腫瘤細胞侵襲和遷移能力以及細胞增殖水平的變化。<

14、br>　　 結(jié)果:
　　 Lewis肺癌細胞在與胚胎干細胞經(jīng)非接觸式共培養(yǎng)后，與對照組相比，實驗組Lewis肺癌細胞體外增殖受到顯著抑制，大部分Lewis肺癌細胞周期被阻滯在G2/M期，凋亡的細胞數(shù)目明顯增多，并且腫瘤細胞遷移和侵襲能力明顯下降，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 胚胎干細胞具有顯著的體外抗腫瘤作用，包括能夠抑制腫瘤細胞增殖，阻滯腫瘤細胞周期、促進腫瘤細胞凋亡，并且明

15、顯改變腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，在一定程度上抑制其惡性表型。
　　 第二節(jié)胚胎干細胞對Lewis肺癌細胞成瘤能力的影響
　　 研究目的:
　　 研究Lewis肺癌細胞在與胚胎干細胞在體外共培養(yǎng)后對其成瘤能力影響，并探討這一過程中相關(guān)的作用機制。
　　 研究方法:
　　 通過建立C57/BL6小鼠Lewis肺癌動物模型，研究與胚胎干細胞共培養(yǎng)后Lewis肺癌細胞的體內(nèi)成瘤能力的改變，主要檢測實驗組與

16、對照組小鼠皮下移植性腫瘤體積和重量的變化，并通過TUNEL方法檢測腫瘤組織內(nèi)細胞腫瘤細胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)與胚胎干細胞共培養(yǎng)后，Lewis肺癌細胞的成瘤能力顯著下降，主要表現(xiàn)在實驗組小鼠皮下腫瘤體積的增大和重量的增加均受到顯著的抑制，并且實驗組小鼠腫瘤組織中細胞凋亡的程度明顯增加，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 胚胎干細胞在體外共培養(yǎng)過程中能夠明顯抑制Lew

17、is肺癌細胞的成瘤能力，顯著抑制其在體內(nèi)實體腫瘤的生長，并誘導細胞凋亡增加，成瘤能力作為典型的惡性表型受到抑制，這種作用可能與胚胎干細胞能夠在體外抑制Lewis肺癌細胞群體中腫瘤干細胞的活性有關(guān)。
　　 第二部分胚胎干細胞抗Lewis肺癌作用的體內(nèi)研究
　　 第一節(jié)胚胎干細胞對Lewis肺癌發(fā)生的預防作用研究
　　 研究目的:
　　 研究實驗小鼠經(jīng)接種胚胎干細胞后，誘導體內(nèi)抗腫瘤免疫反應的發(fā)生機制，及其對

18、腫瘤發(fā)生的預防作用。
　　 研究方法:
　　 將γ射線滅活的胚胎干細胞經(jīng)皮下注射進入C57/BL6小鼠體內(nèi)完成免疫接種，在重復接種3次后檢測小鼠免疫指標水平，主要通過流式細胞術(shù)檢測外周血淋巴細胞（CD3+、CD4+、CD8+T細胞和CD19+B細胞）數(shù)量及比例、ELISA檢測血清細胞因子(IL-2、IL4和IFN-γ)水平，接種Lewis肺癌細胞后，監(jiān)測小鼠腫瘤生長情況并繪制腫瘤生長曲線，待動物實驗結(jié)束后，檢測脾臟淋巴細

19、胞增殖情況，剝離腫瘤組織、秤重并制作組織切片，IHC檢測腫瘤組織內(nèi)CTL淋巴細胞浸潤程度，TUNEL檢測腫瘤組織細胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 與對照組相比，經(jīng)胚胎干細胞免疫接種的實驗組小鼠外周血CD3+/CD8+T淋巴細胞絕對值和比例明顯升高、血清Th1型抗腫瘤細胞因子(IL-2和IFN-γ)水平顯著升高，脾臟T淋巴細胞增殖顯著，腫瘤發(fā)生率明顯降低(P＜0.05);即使在有腫瘤生長的實驗組小鼠，其實體腫瘤生長速度受

20、到顯著抑制，病理學顯示其腫瘤組織CTL淋巴細胞浸潤明顯增加，腫瘤組織內(nèi)部細胞凋亡具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 接種胚胎干細胞能誘導機體產(chǎn)生顯著的抗腫瘤預防作用，小鼠體內(nèi)抗腫瘤細胞免疫水平明顯提高，能夠有效地抑制小鼠移植性腫瘤的發(fā)生。
　　 第二節(jié)胚胎干細胞對Lewis肺癌進展的治療作用研究
　　 研究目的:
　　 研究胚胎干細胞在小鼠腫瘤模型中誘導抗腫瘤免疫反應的發(fā)生機制，

21、及其對腫瘤發(fā)展的治療作用。
　　 研究方法:
　　 采用C57/BL6小鼠皮下接種Lewis肺癌細胞建立腫瘤動物模型，并利用接種時間的長短和皮下瘤塊的生長情況模擬不同的腫瘤發(fā)展時期，將γ射線滅活的胚胎干細胞經(jīng)皮下注射進入小鼠體內(nèi)（共3次間隔7天）進行免疫治療，通過流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血淋巴細胞數(shù)量和比例變化、ELISA檢測血清細胞因子水平，監(jiān)測皮下腫瘤生長情況并繪制腫瘤生長曲線，待動物實驗結(jié)束后剝離腫瘤組織稱重，通過I

22、HC檢測脾臟淋巴細胞增殖情況和腫瘤組織淋巴細胞浸潤程度，TUNEL檢測腫瘤細胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 在腫瘤模型小鼠中接種胚胎干細胞能夠刺激機體CD3+/CD8+T淋巴細胞增殖，血清Th1型抗腫瘤細胞因子（IL-2和IFN-γ）水平顯著升高(P＜0.05)，荷瘤鼠的免疫抑制狀態(tài)得到改善，實體腫瘤的生長得到顯著抑制，病理學顯示實驗組小鼠脾臟T淋巴細胞增殖明顯增多，腫瘤組織局部有更多CTL淋巴細胞浸潤，腫瘤細胞凋亡程