利用轉(zhuǎn)基因豬模型研究PGC1α對(duì)肌纖維類型轉(zhuǎn)變的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、豬是中國(guó)最重要的肉類食用動(dòng)物，豬肉的品質(zhì)是重要經(jīng)濟(jì)性狀。影響豬肉品質(zhì)的因素有很多，例如嫩度、肌內(nèi)脂肪、肉色等。肌纖維類型與這些因素都有著直接的關(guān)系，是目前豬肉品質(zhì)研究的熱點(diǎn)，所以發(fā)現(xiàn)肌纖維類型轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)理，對(duì)于提高豬的肉質(zhì)性狀有重要的意義。過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子α(Peroxisomeproliferator-activated receptor gamma coactivator1 alpha，PGC1α)是一種轉(zhuǎn)錄因子共

2、激活因子，能有效地誘導(dǎo)線粒體的生物合成和細(xì)胞呼吸功能，是調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化的主要因子之一。本研究在轉(zhuǎn)基因豬模型中驗(yàn)證了利用MCK啟動(dòng)子超表達(dá)PGC1α基因后對(duì)骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)化的影響，并對(duì)轉(zhuǎn)PGC1α基因豬和野生型豬進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，進(jìn)一步尋找PGC1α基因引起表型變化的調(diào)控機(jī)理。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.在前期制備的原代轉(zhuǎn)PGC1α基因豬的基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)基因豬群進(jìn)行擴(kuò)繁。分別對(duì)3月齡和6月齡的轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行了屠宰實(shí)驗(yàn)，通過P

3、CR的方法進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。觀察了兩個(gè)月齡豬的肌肉形態(tài)，結(jié)果顯示腓腸肌和背最長(zhǎng)肌的顏色都稍有變紅。對(duì)6月齡的轉(zhuǎn)基因豬和野生型豬進(jìn)行了性狀的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬肌肉滴水損失顯著降低，其他與肉質(zhì)相關(guān)的一些性狀指標(biāo)也產(chǎn)生了差異，如肉色評(píng)分、大理石紋評(píng)分、肌內(nèi)脂肪和嫩度等升高了，但未達(dá)到顯著水平。
　　2.開展了免疫組化和ATP酶染色的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示氧化型肌纖維（Ⅰ型肌纖維）的數(shù)目顯著增多，酵解型肌纖維（ⅡB型肌纖維）的數(shù)目則顯著減少。HE染色

4、結(jié)果表明肌纖維的密度和數(shù)目有所增加，而肌纖維的橫截面積卻減小了。這些都說明了PGC1α的超表達(dá)能夠使酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉(zhuǎn)化，同時(shí)引起肌纖維密度和數(shù)目的增多，橫截面積的減少。
　　3.建立了3月齡和6月齡轉(zhuǎn)基因豬和野生型豬的PGC1α基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)PGC1α基因在較多組織中都有表達(dá)量的上調(diào)，例如腎、肝、胃、腹脂、肌肉組織等，其中在腓腸肌和背最長(zhǎng)肌達(dá)到了顯著水平，驗(yàn)證了PGC1α超表達(dá)載體上的MCK啟動(dòng)子的功能具有肌肉組織特

5、異性。此外，在腎、肝中也顯著超表達(dá)。對(duì)3月齡和6月齡轉(zhuǎn)PGC1α基因豬的腓腸肌和背最長(zhǎng)肌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)氧化型肌纖維相關(guān)基因(MYHCⅠ、MYHCⅡA、Myog、Myoglobin、TNNI1和CS等)都上調(diào)表達(dá)，而酵解型肌纖維相關(guān)基因（MYHCⅡB、Myod、TNNI2等）則下調(diào)表達(dá)。一些PGC1α基因調(diào)控的下游基因也發(fā)生了變化，其中上調(diào)的有MEF2C、CPT-1B、NRF-1、PPARγ和ABP3，下調(diào)的有FOX

6、O1和Myostatin。
　　4.對(duì)3月齡轉(zhuǎn)基因豬和野生型豬的腓腸肌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共檢測(cè)到了371個(gè)差異表達(dá)基因(P-value＜=0.05; Ratio＞=2)。其中，上調(diào)的基因有184個(gè)（有基因注釋的147個(gè)），下調(diào)的基因有187個(gè)（有基因注釋的127個(gè)）。在此基礎(chǔ)上篩選出與肌纖維類型有關(guān)的10個(gè)差異表達(dá)基因（上調(diào):TNNI1、Myog、FABP3、MYHCⅠ、FAT、SDH、CPT-1B;下調(diào):FOXO1、MSTN、I

7、RS1）驗(yàn)證了測(cè)序的可靠性，分析差異基因顯著富集的通路，初步發(fā)現(xiàn)PGC1α主要是通過MSTN、Myog、FOXO1信號(hào)通路和PPAR信號(hào)通路來調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)變。此外還發(fā)現(xiàn)了一些新的可變剪接、SNP、轉(zhuǎn)錄本等。
　　綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)基因豬模型發(fā)現(xiàn)超表達(dá)PGC1α對(duì)酵解型肌纖維有負(fù)調(diào)控作用，對(duì)氧化型肌纖維有正調(diào)控作用。分析差異表達(dá)基因得知PGC1α通過MSTN、Myog、FOXO1信號(hào)通路和PPAR信號(hào)通路來促進(jìn)氧化型肌纖維相