豬Sox6的基因克隆、原核表達(dá)及其在調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、由于傳統(tǒng)的飲食習(xí)慣，豬肉成為世界消費量最大的肉產(chǎn)品。隨著國家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平越來越高，消費者對豬肉品質(zhì)的要求也越來越高。而豬肉品質(zhì)與肌纖維類型密切相關(guān)。根據(jù)肌球蛋白（MyHC）亞型，肌纖維可分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型，分別以表達(dá)MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx和MyHCⅡb為主。提高Ⅰ型肌纖維在肌肉中的比例可有效地改善豬肉品質(zhì)。Sox6是轉(zhuǎn)錄因子Sox基因家族的重要成員，參與肌纖維類型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)，影響肌肉中Ⅰ型肌纖維的比

2、例。因此，Sox6在豬肉品質(zhì)調(diào)控方面有潛在的應(yīng)用。但有關(guān)豬Sox6的研究目前在國內(nèi)外尚未見報道。本研究旨在克隆豬Sox6基因，構(gòu)建豬Sox6原核和真核表達(dá)載體，制備重組豬Sox6蛋白，考察過表達(dá)豬Sox6和外源添加重組豬Sox6蛋白對肌纖維類型轉(zhuǎn)化的影響。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　試驗一 豬Sox6基因編碼區(qū)全序列克隆及組織表達(dá)規(guī)律分析
　　Sox6屬于轉(zhuǎn)錄因子Sox基因家族的一員，參與肌纖維類型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)，是慢肌特異基

3、因的抑制子，影響肌肉中Ⅰ型肌紓維的含量。但豬Sox6基因序列目前尚不清楚。為此，本研究以3日齡DLY（Duroc×Landrace×Yorkshire）仔豬為試驗材料，取500mg背最長肌用于總RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)已知的小鼠、大鼠和人的Sox6編碼區(qū)序列，設(shè)計一對簡并引物用于擴(kuò)增豬Sox6基因目的片段。DNA測序結(jié)果顯示，豬Sox6基因編碼區(qū)全序列大小為2406bp，編碼801個氨基酸。將該序列提交至GenBank，獲得的

4、序列登錄號為KF933861。序列分析結(jié)果表明，豬Sox6基因核苷酸序列與已知的人、小鼠、大鼠和牛的Sox6基因核苷酸序列同源性分別為87.7％、86.71％、90.91％、89.49％。序列分析結(jié)果同時表明，豬Sox6蛋白的氨基酸序列與已知的人、小鼠、大鼠和牛的Sox6蛋白的氨基酸序列同源性分別為89.9％、90.74％、95.26％、90.53％，含有Sox6蛋白保守（100％同源）的HMG box、N端和C端的Q-box、亮氨酸拉

5、鏈結(jié)構(gòu)，暗示豬Sox6可能具有與已報道的其他物種Sox6相類似的功能。接下來，以10周齡DLY豬（母）為研究對象，采用實時熒光定量PCR檢測豬Sox6基因在心、肝、腎、脂肪、背最長肌、趾長伸肌、比目魚肌、腰大肌、脛骨前肌組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，豬Sox6 mRNA在豬心臟和骨骼肌中表達(dá)最豐富，在腎臟、脂肪、肝臟、脾臟和肺組織中也可檢測到，且在不同類型骨骼肌組織中存在表達(dá)差異（背最長肌＞趾長伸?。颈饶眶~肌）。
　　試驗二 豬So

6、x6基因在大腸桿菌中的表達(dá)和純化
　　以pET-30a(+)為載體，成功構(gòu)建了用于表達(dá)C端融合6×His-Tag的重組豬Sox6的原核表達(dá)載體pET-30a(+)-pSox6。以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主菌，實現(xiàn)了豬Sox6基因的表達(dá)，目的蛋白分子量約為90 kDa。為獲得最佳蛋白表達(dá)條件，分別設(shè)置了0mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mm

7、ol/L、3.0 mmol/LIPTG誘導(dǎo)濃度和分別設(shè)置了1h、3h、4h、5h、6h、8h表達(dá)時間點，SDS-PAGE結(jié)果表明，重組蛋白最佳表達(dá)條件為在30℃下用1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h。溶解性分析結(jié)果表明，重組蛋白以可溶性方式存在。表達(dá)產(chǎn)物采用親和層析法進(jìn)行純化，最終重組蛋白濃度約為5μg/mL。對純化后的重組蛋白進(jìn)行Western blot和蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)鑒定，結(jié)果表明，純化的重組蛋白為豬Sox6

8、蛋白。
　　試驗三 豬Sox6在調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用
　　在成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-pSox6、獲得重組豬Sox6蛋白和分離原代豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的基礎(chǔ)上，本研究考察了豬Sox6對肌纖維類型轉(zhuǎn)化的影響。首先，采用肌肉注射方法將pcDNA3.1(+)-pSox6質(zhì)粒注射到小鼠脛骨前肌中，在動物水平探討過表達(dá)豬Sox6對MyHC各亞型表達(dá)的影響。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，過表達(dá)豬Sox6顯著下調(diào)了M

9、yHCⅠmRNA的表達(dá)，同時顯著上調(diào)了MyHCⅡa、MyHCⅡx和MyHCⅡbmRNA的表達(dá)。Western Blot結(jié)果表明，過表達(dá)豬Sox6下調(diào)了MyHCⅠ蛋白的表達(dá)，同時上調(diào)了MyHCⅡb蛋白的表達(dá)。其次，以C2C12細(xì)胞為對象，從體外水平探討了過表達(dá)豬Sox6對MyHCⅠ和MyHCⅡb蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明，過表達(dá)豬Sox6下調(diào)了C2C12細(xì)胞中MyHCⅠ蛋白的表達(dá)，同時上調(diào)了C2C12細(xì)胞中MyHCⅡb蛋白的表達(dá)。最后，在體

10、外水平探討了外源添加重組豬Sox6蛋白對原代豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中慢肌纖維相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，外源添加重組豬Sox6蛋白顯著下調(diào)了豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中MyHCⅠ、Tnnt1、Tnnc1、Tnni1 mRNA的表達(dá)。上述結(jié)果表明，豬Sox6在調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要的作用。
　　總之，本研究成功克隆了豬Sox6基因編碼區(qū)全序列并發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)于豬心臟和骨骼肌中，首次用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、親和層析純化以及稀釋復(fù)性的方法獲得了具