艾塞那肽對(duì)NAFLD細(xì)胞模型中PGC-1α表達(dá)的影響及其機(jī)制.pdf

1、背景：非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是由于肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度蓄積所引起的臨床病理綜合征，除外酒精和病毒性肝炎、自身免疫性肝病等其他明確的可能導(dǎo)致肝臟脂肪變性的因素，目前已經(jīng)成為全球普遍流行的慢性肝臟病。大量的基礎(chǔ)及臨床研究用來揭示 NAFLD的發(fā)病機(jī)制，但是有關(guān)肝細(xì)胞中脂質(zhì)過多蓄積及其疾病進(jìn)展中的異常代謝機(jī)制仍有待進(jìn)一步的闡明。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)最初是在棕色脂肪組織中作為過氧化物酶體增殖物激活受體

2、γ的共激活因子來調(diào)節(jié)適應(yīng)性產(chǎn)熱而被發(fā)現(xiàn)的，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn) PGC-1α在高能量需求的組織中表達(dá)豐富，包括棕色脂肪組織、心肌、骨骼肌、肝臟及腎臟等。肝臟中 PGC-1α的表達(dá)在產(chǎn)后期的較早階段達(dá)到高峰，其能夠協(xié)調(diào)肝臟中復(fù)雜的代謝改變?nèi)缣钱惿?，酮體生成，血紅素的合成及膽汁酸代謝。越來越多的研究表明，PGC-1α在胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂及線粒體功能失調(diào)等與 NAFLD發(fā)病相關(guān)的因素中有著重要調(diào)節(jié)作用。PGC-1α的表達(dá)受到多種信號(hào)

3、通路的調(diào)節(jié)如 AMP活化的蛋白激酶（AMPK）及促分裂原活化的蛋白激酶p38（p38MAPK）等。艾塞那肽作為一種胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動(dòng)劑，具有調(diào)節(jié)胰島素敏感性的作用，目前被普遍應(yīng)用于2型糖尿病的治療。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1不僅能夠調(diào)節(jié)血糖、減輕體重，其在改善肝細(xì)胞脂肪變方面也起著重要作用。AMPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝的重要因子，Shani BS等研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1可通過激活A(yù)MPK來減輕肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積。目

4、前關(guān)于GLP-1對(duì)人肝細(xì)胞LO2細(xì)胞中PGC-1α表達(dá)的影響及相關(guān)分子機(jī)制的研究較少，因此，探討GLP-1能否通過AMPK通路調(diào)節(jié)PGC-1α的表達(dá)，進(jìn)而改善肝細(xì)胞中的脂質(zhì)堆積，有可能為GLP-1治療NAFLD提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
　　目的：⑴體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞LO2系，用游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)以建立NAFLD細(xì)胞模型。⑵觀察艾塞那肽干預(yù)對(duì)NAFLD細(xì)胞模型中PGC-1α表達(dá)及脂質(zhì)堆積的影響，以及 PGC-1α的表達(dá)與肝細(xì)胞

5、中脂質(zhì)堆積的關(guān)系，探討艾塞那肽用于治療NAFLD的作用機(jī)制。
　　方法：用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。第一部分共分6組：①正常組，即未加FFA；②FFA0.5mM組；③FFA0.75mM組；④FFA1mM組；⑤FFA1.25mM組；⑥FFA1.5mM組。各組均培養(yǎng)24h后，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，判斷最適FFA濃度。根據(jù)結(jié)果，選取FFA1mM作為模型組，干預(yù)

6、24h后，進(jìn)行油紅O染色，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（triglyceride，TG）測(cè)定來評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積程度，判斷造模是否成功。第二部分共分為5組：①正常對(duì)照組：培養(yǎng)基中未加FFA；②高脂組：培養(yǎng)基中 FFA濃度為1mmol/L；③高脂+艾塞那肽10nmol/L組：FFA濃度為1mmol/L，艾塞那肽濃度為10nmol/L；④高脂+艾塞那肽100 nmol/L組：FFA濃度為1mmol/L，艾塞那肽濃度為100nmol/L；⑤高脂+艾塞那肽1

7、00 nmol/L+AMPK抑制劑組：培養(yǎng)基中 FFA濃度為1mmol/L，艾塞那肽濃度為100nmol/L，AMPK抑制劑Compound C濃度為15μmol/L。各組均在相同環(huán)境下干預(yù)24h后,采用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴生成情況，細(xì)胞內(nèi)TG水平測(cè)定評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)PGC-1α及乙

8、酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）的mRNA表達(dá)水平，Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)PGC-1α蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴CCK-8結(jié)果顯示：與正常組相比，0.5mmol/L、0.75mmol/L和1mmol/L FFA干預(yù)24h對(duì)LO2細(xì)胞活力無明顯影響（P>0.05），1.25mmol/L FFA和1.5mmol/L FFA干預(yù)24h后LO2細(xì)胞活力下降（P<0.05），

9、提示可選用1mmol/L PA干預(yù)進(jìn)行造模，從而避免對(duì)細(xì)胞活力的影響。油紅O染色結(jié)果顯示模型組細(xì)胞內(nèi)可見聚集成片的紅染脂滴，而正常組則未見明顯脂滴形成。細(xì)胞內(nèi)TG水平測(cè)定同樣顯示模型組細(xì)胞內(nèi) TG水平較正常組明顯增高（P<0.05）。⑵與正常組相比，高脂組細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴明顯增多，細(xì)胞內(nèi)TG水平增高（P<0.05），ACC mRNA的表達(dá)明顯增加（P<0.05），PGC-1αmRNA與蛋白的表達(dá)明顯下降（P<0.05）；與高脂組相比，給予

10、艾塞那肽10nmol/L及100nmol/L干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量，細(xì)胞內(nèi)TG含量和ACC mRNA的表達(dá)水平均下降，并且艾塞那肽100nmol/L干預(yù)組較艾塞那肽10nmol/L干預(yù)組降低的水平更多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而PGC-1α mRNA與蛋白的表達(dá)水平增高，且艾塞那肽100nmol/L干預(yù)組較艾塞那肽10nmol/L干預(yù)組水平增高的更多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與高脂+艾塞那肽100nmol/L組相比

11、，高脂+艾塞那肽100 nmol/L+AMPK抑制劑組細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴數(shù)量，細(xì)胞內(nèi)TG水平和ACC mRNA的表達(dá)水平均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而PGC-1αmRNA與蛋白的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LO2細(xì)胞中PGC-1α mRNA和蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)TG的水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.799，r=-0.826，P<0.01）。
　　結(jié)論：GLP-1受體激動(dòng)劑艾塞那肽可減輕肝