抑制PGC-1α的表達(dá)對(duì)PD模型小鼠炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、帕金森病(PD)是繼阿爾茨海默病之后的第二種最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，也是中老年中發(fā)病率較高的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。PD的主要特征表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、僵硬、震顫和姿勢(shì)不穩(wěn)定性。雖然這些癥狀已經(jīng)是PD的經(jīng)典描述，但最近其被公認(rèn)為是一個(gè)更加復(fù)雜的疾病，包括運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀(NMS)，如抑郁癥、睡眠障礙、感覺(jué)異常、植物神經(jīng)功能紊亂和認(rèn)知能力的下降。研究發(fā)現(xiàn)，與PD發(fā)生密切的因素主要有線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、α-突觸核蛋白基因突變等遺傳因素、環(huán)

2、境因素、炎癥反應(yīng)等，但具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。
　　在上述眾多因素中，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)PD的主要因素。線粒體是生命個(gè)體中直接提供能量的細(xì)胞器，其在維持神經(jīng)元正常功能上起到非常重要的作用。線粒體復(fù)合物Ⅰ(mitochondrial complexⅠ)是線粒體呼吸鏈中最大的復(fù)合體，是線粒體發(fā)揮氧化磷酸化功能的關(guān)鍵。其異常可以引起活性氧自由基(reactive oxygenspecies，ROS)生成增多，從而引發(fā)細(xì)

3、胞損傷，乃至死亡。
　　除此之外，膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)的炎癥反應(yīng)對(duì)PD的影響逐漸成為研究的熱點(diǎn)。在正常情況下，膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)。當(dāng)神經(jīng)元損傷導(dǎo)致免疫原性分子釋放時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)變形形態(tài)，并顯示出相應(yīng)的活化表型。神經(jīng)炎癥最顯著的特點(diǎn)是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活與增生。膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以產(chǎn)生大量有害的活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，與此同時(shí)，還可以分泌大量促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和干擾素γ(IFN-γ)，結(jié)合

4、神經(jīng)元受體從而啟動(dòng)細(xì)胞的死亡途徑。
　　近年來(lái)，有多種生理功能活性的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的共激活因子1α(PGC-1α)受到越來(lái)越多的關(guān)注。其功能除了對(duì)線粒體的生物發(fā)生及代謝過(guò)程起到非常重要的作用外，還發(fā)現(xiàn)PGC-1α有抑制炎癥反應(yīng)的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活與增生而抑制炎癥反應(yīng)的過(guò)程，從而對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用。但在PD發(fā)生過(guò)程中，PGC-1α起到何種作用？其表達(dá)的變化與

5、炎癥反應(yīng)和PD發(fā)生之間是何種關(guān)系？這是一個(gè)值得深入探討的問(wèn)題。本研究擬通過(guò)降低PGC-1α的表達(dá)，觀察其表達(dá)情況與炎癥反應(yīng)之間關(guān)系、是否對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用、以及是否可以改善PD小鼠的癥狀等對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探討。
　　本研究以C57BL/6小鼠為對(duì)象，用立體定位注射方法將構(gòu)建的抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體注射至小鼠的一側(cè)黑質(zhì)，飼養(yǎng)28 d后，再通過(guò)腹腔注射MPTP的方法復(fù)制PD小鼠亞急性模型。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（立體定位sali

6、ne，腹腔注射saline，記為saline+saline組）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（立體定位saline，腹腔注射MPTP30 mg/kg，記為MPTP+saline組）、實(shí)驗(yàn)空載組（立體定位空載慢病毒載體NCKD，腹腔注射MPTP，記為MPTP+NCKD組）、實(shí)驗(yàn)組（立體定位抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體，腹腔注射MPTP，記為MPTP+KD組）。采用行為學(xué)方法檢測(cè)帕金森癥狀;免疫熒光染色方法檢測(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH、PGC-1α等陽(yáng)性細(xì)胞，以及小膠

7、質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物Iba1(ionized calcium-bindingadapter molecule1，Iba1)的數(shù)量和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP(Glial Fiber Acid Protein，GFAP)的累積光密度;FJC染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞的數(shù)量;Western blot技術(shù)檢測(cè)TH、PGC-1α蛋白在黑質(zhì)內(nèi)的表達(dá)情況，以探究抑制PGC-1α的表達(dá)對(duì)PD小鼠行為癥狀，以及炎癥反應(yīng)相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況的影響，

8、揭示PGC-1α、炎癥和PD之間的關(guān)系。
　　所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.用腹腔注射MPTP(30 mg/kg)的方法成功復(fù)制出PD小鼠模型。并隨著MPTP注射天數(shù)的增加，存活的多巴胺能神經(jīng)元、PGC-1α陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增加;TH、PGC-1α蛋白表達(dá)量越來(lái)越少;炎癥反應(yīng)越來(lái)越重，最終確定MPTP最佳損傷時(shí)間窗為3d。
　　2.成功構(gòu)建了抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體，用qPCR方法檢測(cè)出最佳干擾靶

9、點(diǎn)，通過(guò)熒光法測(cè)定出病毒的最佳滴度為5×108 TU/ml。
　　3.MPTP+KD組黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)量較MPTP+saline組顯著減少(P＜0.05);MPTP+KD組小鼠自主活動(dòng)及站立次數(shù)較MPTP+saline組呈下降趨勢(shì)，而轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)以及游泳停頓時(shí)間較MPTP+saline組呈遞增趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.MPTP+KD組黑質(zhì)PGC-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較MPTP+saline組顯著減少(P＜0.05)，這表

10、明立體定位注射抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體起到了減少PGC-1α表達(dá)的作用。
　　5.定位注射抑制PGC-1α表達(dá)的慢病毒載體后，MPTP+KD組黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)量較MPTP+saline組顯著降低(P＜0.05)。提示炎癥反應(yīng)降低。
　　通過(guò)上述結(jié)果的分析，得出如下結(jié)論:
　　1.通過(guò)炎癥與DA神經(jīng)元的存活與凋亡確定了MPTP最佳損傷時(shí)間窗為3d。
　　2.篩選出抑制PGC-1α表達(dá)的