融合表達(dá)Ag85B-ESAT6的結(jié)核病疫苗的構(gòu)建及其免疫學(xué)特性研究.pdf

1、MTB早期培養(yǎng)濾液蛋白(CFP)中的Ag85B和ESAT6是重要的保護(hù)性抗原,廣泛用于新型TB疫苗研究.該研究先后構(gòu)建了融合表達(dá)Ag85B和ESAT6基因的亞單位疫苗、基因疫苗以及重組BCG疫苗,并比較了各自誘發(fā)的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平和對(duì)感染小鼠的保護(hù)力,以期為TB的防治提供新型疫苗.設(shè)計(jì)了含不同酶切位點(diǎn)的ag85b和esat6引物,采用PCR的方法從MTB毒株H37Rv-DNA中分別擴(kuò)增出相應(yīng)大小的DNA片段,將目的片段與pGEM-T-e

2、asy載體連接后測(cè)序,PCR獲得的ag85b和esat6序列與GenBank報(bào)道的完全一致.將測(cè)序正確的ag85b和esat6按照不同的酶切位點(diǎn)聯(lián)合克隆入pProEX HT表達(dá)載體,成功誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,同時(shí)與6×his的單克隆抗體(mAb)進(jìn)行Western-blot分析,為了檢測(cè)融合蛋白免疫小鼠引起的細(xì)胞免疫應(yīng)答,最后一次免疫完成四周后,分離免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞,體外用CFP刺激,結(jié)果融合蛋白Ag85B-ESAT6和ESAT6-Ag

3、85B誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ分別為3.51±0.30ng/ml和4.05±0.41ng/ml,顯著高于生理鹽水對(duì)照組(0.5±0.25ng/ml,P<0.05),但不及BCG免疫組(5.55±0.31ng/ml).將ag85b和esat6按照不同的酶切位點(diǎn)克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3,分別命名為A<,z>-pcDNA3-E<,F>和E<,z>-pcDNA3-A<,F>.將重組質(zhì)粒A<,z>-pcDNA3-E<,F>和E<,z>-pcDN

4、A3-A<,F>電轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞,RT-PCR檢測(cè)融合蛋白mRNA的表達(dá),用間接免疫熒光可以在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的CHO細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到較強(qiáng)的綠色熒光,證實(shí)CHO細(xì)胞內(nèi)融合蛋白的表達(dá).采用PCR方法從MTB毒株H37Rv-DNA擴(kuò)增出熱休克蛋白Hsp60基因及其信號(hào)肽序列α-ss,將測(cè)序正確的hsp60和α-ss分別克隆入E.coli-BCG穿梭載體pOLYG中,構(gòu)建分枝桿菌分泌表達(dá)載體pDE22,按相應(yīng)的酶切位點(diǎn)將ag85b和esat6按照不同的