ESAT-6-Ag85A融合基因DNA疫苗增強卡介苗初免的免疫原性和保護性.pdf

1、背景與目的：
　　 使用BCG作為初免疫苗的異源性初免增強方案，可能將成為最有希望的新型TB免疫措施。ESAT-6和Ag85A是機體抗TB感染的兩個主要的保護性抗原。本研究中，我們克隆了ESAT-6和Ag85A的融合基因，分別構(gòu)建了表達ESAT-6和Ag85A融合蛋白的原核表達質(zhì)粒pPro685A和真核表達質(zhì)粒pcD685A，研究了pcD685A增強BCG初免誘導的免疫反應，同時探討pcD685A增強BCG初免對小鼠抗TB感染的

2、保護性。
　　 方法：
　　 1．利用PCR技術(shù)從M.tb H37Rv 株中擴增Ag85A 編碼基因fbpA和ESAT-6 編碼基因esxA，利用基因拼接(GeneSOEing)方法，合成esxA-fbpA 融合基因,并分別克隆入原核表達載體pProEXHTb和真核表達載體PcDNA3.1(+)中，重組質(zhì)粒命名為pPro685A和pcD685A。
　　 2．將pPro685A 重組原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌

3、BL21，誘導并純化出r685A 蛋白。蛋白的表達和純化的過程，分別用SDS-PAGE 驗證，并用anti-ESAT-6和anti-Ag85A Ab 經(jīng)Western blotting 驗證。純化r685A 蛋白的純度進一步用SDS-PAGE 證實，并經(jīng)BCA 法定量。
　　 3．將pcD685A 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli DH5α，規(guī)模化提取、純化pcD685A重組質(zhì)粒，并經(jīng)分光光度法測定質(zhì)粒濃度。
　　 4．

4、利用BCG（中國株）初免pcD685A 增強的方式免疫C57BL/6 小鼠。通過ELISA法檢測外周血抗r685A 蛋白IgG 抗體，qRT-PCR檢測肺臟表達的IFN-γ和IL-10的手段，來評價在小鼠模型中的免疫原性。
　　 5．對免疫后小鼠用M.tb H37Rv 毒株攻擊實驗進行攻擊，測定組織荷菌量、組織病理學改變等指標評價疫苗的保護性。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功的構(gòu)建了esxA-fbpA融合基因的真核

5、表達載體和原核表達載體。
　　 2．SDS-PAGE和Western blotting證實r685A原核表達和純化成功。純化的r685A經(jīng)SDS-PAGE證實。
　　 3．pcD685A誘導表達了特異性IgG的抗體反應，BCG初免pcD685A增強免疫組明顯高于其它組。qRT-PCR檢測肺臟細胞因子，除了空載體組，其他各組的IFN-γ反應水平均增加。pcD685A增強BCG初免組誘導小鼠肺臟產(chǎn)生了最高劑量的IFN-γ，并

6、比單獨BCG組或者pcD685A組IFN-γ有顯著提高。
　　 4．更重要的是pcD685A增強免疫BCG初免與單獨BCG或pcD685A組相比，能明顯的減少肺臟和脾臟的荷菌量。
　　 5．小鼠用M.tb H37Rv毒株攻擊后，肺臟組織病理學檢查結(jié)果顯示BCG初免pcD685A增強組的肺臟病理變化最輕微。
　　 結(jié)論：
　　 因此，我們的研究顯示pcD685A可能將是一種有效地增強BCG免疫的抗TB疫苗。