新型結(jié)核病疫苗免疫組分和診斷分子標(biāo)識(shí)候選物的初步篩選及鑒定.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis，TB)一直是一個(gè)嚴(yán)重的全球公共健康問題，其死亡率居于單一細(xì)菌感染致死亡性疾病之首。傳統(tǒng)的結(jié)核病檢測(cè)方法有痰涂片，痰培養(yǎng)，PCR，ELISPOT，TST，胸片等，但是它們存在明顯的不足，比如有的耗時(shí)較長(zhǎng)，有的假陽(yáng)性率高，而且不能對(duì)結(jié)核分枝桿菌菌陰的病人進(jìn)行正確診斷。因此需要尋找一種準(zhǔn)確、快速、新的診斷方法，為后期臨床治療提供依據(jù)?，F(xiàn)今細(xì)胞免疫檢測(cè)方法使用的抗原有ESAT-6，CFP10和TB7.7，血清學(xué)

2、檢測(cè)使用的抗原是38kDa(Rv0934)。目前臨床上使用的唯一預(yù)防性結(jié)核病疫苗-卡介苗對(duì)兒童結(jié)核性腦膜炎具有保護(hù)作用，但是對(duì)青少年和成人的肺結(jié)核保護(hù)力為0-80％，具有可變性。因此迫切需要研制新型有效的結(jié)核病疫苗。
　　本研究通過(guò)篩選結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白和膜蛋白，尋找潛在的新型結(jié)核病疫苗免疫組分和診斷分子標(biāo)識(shí)候選抗原。
　　首先使用生物信息學(xué)軟件對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株全蛋白質(zhì)組進(jìn)行預(yù)測(cè)分析確定研究對(duì)象。然后將入組的

3、膜蛋白和分泌蛋白進(jìn)行重組表達(dá)。對(duì)表達(dá)獲得的重組蛋白逐一進(jìn)行Western Blot和ELISPOT篩選，根據(jù)第二輪細(xì)胞免疫篩選結(jié)果選取5個(gè)蛋白進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證5個(gè)蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)的免疫原性。最終結(jié)果如下:
　　經(jīng)生物信息學(xué)軟件對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的3989個(gè)開放閱讀框編碼的蛋白預(yù)測(cè)確定有240個(gè)開放閱讀框編碼的膜蛋白和242個(gè)開放閱讀框編碼的分泌蛋白入組。本研究利用Gateway系統(tǒng)和一步克隆法成功構(gòu)建了46

4、7個(gè)表達(dá)克隆，通過(guò)兩輪表達(dá)得到219個(gè)膜蛋白、141個(gè)分泌蛋白。將所有純化得到的蛋白使用離子軌道肼質(zhì)譜驗(yàn)證重組蛋白的蛋白序列是否正確，經(jīng)驗(yàn)證360個(gè)蛋白序列全部正確，正確率100％。
　　經(jīng)過(guò)使用229個(gè)活動(dòng)性肺結(jié)核病病人血清進(jìn)行三輪蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)篩選得到18個(gè)膜蛋白、26個(gè)分泌蛋白反應(yīng)強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照Rv0934的峰面積比值大于1。每個(gè)蛋白使用3個(gè)活動(dòng)性肺結(jié)核病人PBMC進(jìn)行ELISPOT，初次篩選使用73個(gè)活動(dòng)性肺結(jié)核病人P

5、BMC。經(jīng)過(guò)初步篩選得到8個(gè)膜蛋白、9個(gè)分泌蛋白平均反應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照ESAT-6的50％以上。將Western Blot初步篩選得到的17個(gè)蛋白使用健康人和病人血漿進(jìn)行復(fù)篩，得到5個(gè)蛋白反應(yīng)在健康人和病人血漿中反應(yīng)具有差異。
　　將ELISPOT初步篩選結(jié)果得到的17個(gè)蛋白使用15個(gè)ESAT-6陽(yáng)性病人PBMC進(jìn)行復(fù)篩，得到5個(gè)蛋白反應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照ESAT-6的40％以上，可以作為目標(biāo)候選抗原;6個(gè)ESAT-6陰性病人PB

6、MC進(jìn)行復(fù)篩，3個(gè)蛋白可能與ESAT-6互為補(bǔ)充，與ESAT-6組合使用可能會(huì)提高活動(dòng)性肺結(jié)核檢測(cè)的吻合率。
　　蛋白免疫小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S43蛋白能刺激小鼠CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2; S4蛋白能刺激小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。M62，M15，M1蛋白能刺激小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。M15，M1，S43，S4，S71作為抗原刺激脾細(xì)胞時(shí)，可以觀察到CD4+T、C

7、D8+T淋巴細(xì)胞的增殖現(xiàn)象，但是與PBS對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)M15，M1，S43，S4，S71作為抗原刺激脾細(xì)胞時(shí)，可以檢測(cè)到不同細(xì)胞因子不同程度的分泌。
　　本研究已經(jīng)獲得了10個(gè)候選蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫、及免疫原性的初步結(jié)果。這10個(gè)蛋白的應(yīng)用價(jià)值需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。
　　綜上所述，我們首次對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的膜蛋白和分泌蛋白進(jìn)行系統(tǒng)研究，得到了一系列可以用作疫苗候選物或是診斷標(biāo)識(shí)的蛋白。由于結(jié)核分枝桿