新型結(jié)核病疫苗菌株的免疫保護(hù)效力和安全性研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)擬對本課題組利用原生質(zhì)體融合技術(shù)以卡介苗（BCG）和結(jié)核分枝桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)無毒株（H37Ra）為親本菌株所構(gòu)建的新型結(jié)核病疫苗融合菌株（B/R菌株）的免疫保護(hù)效力和安全性進(jìn)行初步研究。
　　方法：對B/R菌株的免疫保護(hù)效力和安全性的研究分別從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分進(jìn)行。（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將204只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為四組：生理鹽水組（36只）、BCG組（56只）、B/R組（56只）、H37Ra組（56只），分別皮內(nèi)

2、接種無菌生理鹽水0.1 ml，BCG菌懸液0.1 ml、B/R菌株菌懸液0.1 ml、H37Ra菌株菌懸液0.1 ml（含活菌數(shù)為1×106個(gè)）。a：觀察接種后各組小鼠一般生存狀況及生存率，記錄接種后第3、6、9、12、15、18周小鼠體重?cái)?shù)值。b:分別于接種后第2、3、6、9、12周時(shí)隨機(jī)抓取BCG組、B/R組、H37Ra組小鼠各4只脫頸處死后，摘取小鼠完整肺臟、脾臟；制成臟器組織勻漿并接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，37℃細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培

3、養(yǎng)20天后計(jì)菌落數(shù)(CFU)。c:分別于免疫后第3、6、9、12、15、18周，隨機(jī)抓取生理鹽水組、BCG組、B/R組、H37Ra組小鼠各6只脫頸處死后稱重；其中第3、6、9周小鼠處死前摘眼球取外周血分離血漿，用ELISA法測小鼠血漿中白細(xì)胞介素2（IL-2）及γ干擾素（IFN-γ）的水平；將處死后的小鼠打開胸腔、腹腔取肺臟、肝臟及脾臟于組織固定液中固定48小時(shí)（脾臟取出后稱重并記錄）制作病理切片行HE染色，觀察各組小鼠肺臟、肝臟、脾臟

4、在各時(shí)間點(diǎn)的病理變化情況。d:根據(jù)所記錄的各組小鼠體重和脾臟重量計(jì)算各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)的脾臟系數(shù)。（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：a:復(fù)蘇并培養(yǎng)巨噬細(xì)胞株RAW264.7，選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞，分別用BCG、B/R、H37Ra菌株菌懸液感染細(xì)胞，利用Annexin V-FITC／PI雙染法分別檢測感染后第6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)各組細(xì)胞的凋亡率。b:提取收集正常C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)，分別用 CG、B/R、H37Ra菌株的菌懸液感染所

5、培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，并在感染后第0、48、96小時(shí)用1％TritonX-100裂解液裂解巨噬細(xì)胞，將裂解得到的液體稀釋1000倍后取適量接種于羅氏培養(yǎng)基上，37℃細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20天后計(jì)菌落數(shù)。
　　結(jié)果:(1）四組小鼠接種后第3、6、9、12、15、18周均無小鼠死亡，一般生存狀態(tài)良好，四組小鼠生存率均為100%；所有觀察時(shí)間點(diǎn)B/R組小鼠體重與生理鹽水組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（2）小鼠臟器菌落計(jì)數(shù)實(shí)

6、驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B/R菌株、BCG及H37Ra菌株均可在小鼠脾臟、肺臟內(nèi)定植生長，B/R菌株在小鼠脾臟、肺臟內(nèi)的定植力較BCG強(qiáng)，較H37Ra稍弱；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）小鼠接種后第3周、6周、9周時(shí)血漿中IL-2及IFN-γ的水平，B/R組較BCG組高，較H37Ra組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（4）小鼠接種后，BCG組、H37Ra組及B/R組小鼠肺臟均表現(xiàn)出不同程度的炎細(xì)胞浸潤和氣道上皮細(xì)胞局部脫失，肺泡間隔增寬等

7、改變；肝臟均有不同程度的肝竇擴(kuò)張淤血，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤，小葉間肝細(xì)胞水樣變、壞死等改變，其中 BCG組與H37Ra組程度相當(dāng)，B/R組病理改變程度較兩者稍輕。小鼠接種后，BCG組、H37Ra組及B/R組小鼠脾臟均有不同程度白髓比例升高，淋巴小結(jié)體積增大；紅髓區(qū)擴(kuò)張淤血，可見多形核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞增多等改變，其中H37Ra組及B/R組程度相當(dāng)，二者均較BCG組改變明顯。（5）小鼠接種后第3、6、9、12周時(shí)小鼠脾臟系數(shù)，B/R組與生理鹽水組

8、相比顯著升高；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；所有觀察時(shí)間點(diǎn)B/R組分別與H37Ra組、BCG組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。(6)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)提示BCG、B/R與H37Ra組均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞株RAW264.7凋亡增加，B/R菌株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡能力與 BCG無異；較 H37Ra菌株增強(qiáng)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（7）巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BCG、B/R菌株、H37Ra菌株均可在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中生存繁殖，B/

9、R菌株在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力與BCG相比無明顯差異；與H37Ra組相比降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1.B/R菌株接種C57BL/6小鼠后不影響小鼠一般生長發(fā)育及生存時(shí)間。2.B/R菌株在C57BL/6小鼠體內(nèi)至少定植3個(gè)月，其定植力較BCG增強(qiáng)，較H37Ra菌株弱。3.B/R菌株在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答水平較BCG顯著增強(qiáng)，較H37Ra菌株弱。4.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明B/R菌株的毒力與