構建及選育新型結核病疫苗菌株的實驗研究.pdf

1、目的：以卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin vaccine, BCG）菌株(簡稱BCG菌株）和結核分枝桿菌國際標準無毒株H37Ra菌株(簡稱H37Ra菌株）為親本菌株，制備BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體的融合菌株，并對融合菌株進行鑒定、培養(yǎng)。
　　方法：⑴利用原生質體技術制備BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體，并對制備影響因素中菌齡、酶解濃度、酶解時間進行探索，優(yōu)化BCG菌株原生質體和H3

2、7Ra菌株原生質體的制備條件。⑵采用三種不同的的再生培養(yǎng)基分別為再生羅氏固體培養(yǎng)基、再生Sauton固體培養(yǎng)基和再生Sauton液體培養(yǎng)基，對BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體分別進行再生培養(yǎng)，優(yōu)化其再生條件。⑶采用熒光染色技術分別標記及鑒定BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體。⑷利用電穿孔技術對已標記的BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體進行電融合，制備融合菌株并優(yōu)化制備融合菌株的條件。⑸利用激光共聚焦顯微鏡對電融

3、合后的融合菌株進行觀察、鑒定并對融合菌株進行再生培養(yǎng)。
　　結果：①利用原生質體技術成功制備了BCG菌株原生質體，在菌齡為18d、酶解濃度為12mg/mL、酶解時間為5h時，是制備BCG原生質體的最優(yōu)條件；制備H37Ra菌株原生質體的最佳條件：菌齡為21d，酶解濃度為12mg/mL、酶解時間為6h。②采用再生羅氏固體培養(yǎng)基、再生Sauton固體培養(yǎng)基和再生Sauton液體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)BCG菌株原生質和H37Ra菌株原生質體，發(fā)現

4、BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體在再生羅氏固體培養(yǎng)基和再生Sauton固體培養(yǎng)基上生長良好，而在再生Sauton液體培養(yǎng)基上幾乎不生長。③采用熒光染色技術分別標記BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體：使用FDA染色標記BCG菌株原生質體，發(fā)現有活性的BCG菌株原生質體呈黃綠色熒光；使用羅丹明B染色標記H37Ra菌株原生質體，發(fā)現有活性的H37Ra菌株原生質體呈紅色熒光。④利用電穿孔技術對熒光標記的BCG菌株原生質體和H3

5、7Ra菌株原生質體進行電融合，最佳的融合條件：融合電壓U=2.2KV，電擊時間t=0.8ms，同時利用激光共聚焦顯微鏡可觀察到融合效率高、活性好，具有紅綠色熒光的BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體的融合菌株。⑤采用再生羅氏固體培養(yǎng)基對BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體進行再生培養(yǎng)，得到活性好、生長良好的融合菌株。
　　結論：⑴利用原生質體技術，制備出BCG菌株原生質體和H37Ra菌株原生質體，并對制備條件進行優(yōu)化，