腺病毒介導(dǎo)人HIF-1α基因在急性心梗后的表達(dá)及對缺血心肌干預(yù)治療遠(yuǎn)期結(jié)果的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 研究腺病毒介導(dǎo)的人低氧誘導(dǎo)因子-1 α(Hypoxia indtJcible factor l α，HIF-1 α)基因在急性心梗模型中能否被有效轉(zhuǎn)染，心肌細(xì)胞凋亡變化以及HIF-1 α的上下游基因細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signaI-regulatedkinase，ERK)、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)，血管內(nèi)皮生長因子(VaSCular endothelial growth

2、factor，VEGF)在長期缺血心肌中的表達(dá)，以此為基礎(chǔ)探討腺病毒介導(dǎo)HIF-1 α轉(zhuǎn)基因治療在心肌缺血中可能的分子機(jī)制及其發(fā)揮作用的時間窗，并以HIF-1 α核酶基因進(jìn)行干預(yù)從而證明HIF-1 α在缺血心肌保護(hù)中發(fā)揮重要作用。 方法： 普通級成年健康新西蘭白兔120只，體重2-2．5kg，雌雄不拘，隨機(jī)分為4組，每組30只。①假手術(shù)組(Sham組)：開胸后，只穿線不結(jié)扎。②不含HIF-l α腺病毒載體轉(zhuǎn)染組(Ad-B

3、lank組)：結(jié)扎后心肌內(nèi)注射不含目的基因的病毒顆粒溶液8 μ I。⑧含HIF-1 α腺病毒載體轉(zhuǎn)染組(Ad-HIF-l α組)：結(jié)扎后心肌內(nèi)注射含目的基因的病毒顆粒溶液8 u l(Ad-HIF-l α滴度為1×10<’13>PFU／m1)。④腺病毒介導(dǎo)的HIF-1 α核酶基因干預(yù)組(Rz-HIF-l α組)：結(jié)扎后心肌內(nèi)注射HIF-1 α核酶基因8μl(Rz-HIF-1 α滴度為1×10<’13>PFU／m1)。 模型制備成功

4、后常規(guī)飼養(yǎng)，于l、7、14、28、56天分別取材分為5個亞組，每組6只。動物取材時經(jīng)左心室心尖部插管，連接于Maclab／8s多功能生理儀，監(jiān)測左心室功能。各組于相應(yīng)時間點(diǎn)，麻醉后取樣，Sham組取左冠狀動脈前降支支配末梢部位心肌，其余各組取左心室梗死邊緣缺血區(qū)心肌組織，分別于液氮中保存和4％戊二醛、10％福爾馬林中固定，用RT-PCR方法檢測HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)，末端原位標(biāo)記(TUNEL)法檢測心肌細(xì)胞凋亡。對于56天

5、長期缺血的各組心肌，透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化，免疫組化方法觀察HIF-lα及其上游ERK、p-ERK，下游VEGF蛋白的定位情況。免疫印跡(Western blot)法定量檢測HIF-1α、ERK、p-ERK、VEGF蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果： l、HE染色的光鏡及電鏡結(jié)果證實(shí)載體注射、取材部位是心肌梗死邊緣缺血心肌。 2、RT-PCR結(jié)果顯示，術(shù)后l天、7天、14天、28天均有外源性HIF-1αmRN

6、A的表達(dá)，56天時已基本無表達(dá)，其中7天時HIF-1αmRNA表達(dá)較l天、14天、28天明顯增多(P<0.05)；VEGFmRNA在Ad-BLANK組、Ad—HIF-1α組和Rz-HIF-1α組均有表達(dá)，其中Ad-HIF-1α組較其他組表達(dá)明顯增多(P<0.05)，Rz-HIF-1α組表達(dá)最少。VEGFmRNA的表達(dá)7天達(dá)高峰，7天時的表達(dá)較其他各時間點(diǎn)明顯增多(P<0.05)。 3、TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡，Sham組基本

7、無凋亡細(xì)胞，Ad-HIF-1α組各時間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡數(shù)較Ad-Blank組明顯減少(P<0.05)；Rz-HIF-1α組各時間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡數(shù)較Ad-Blank組明顯增多(P<0.05)。在各個時間點(diǎn)中，術(shù)后1天凋亡細(xì)胞最多，7天、14天凋亡細(xì)胞逐漸減少，28天和56天的凋亡細(xì)胞數(shù)最少，且二者之間無顯著性差異(P>0.05)。 4、血流動力學(xué)結(jié)果顯示Shaam組LVDP、±dp／dt<,max>最高，Rz-HIF-1α組最低。各個時

8、間點(diǎn)其他各組LVDP、±dp／dt<,max>較Sham組明顯下降(P<0.05)；在7天、14天、28天、56天，Ad-HIF-1a組較Ad-Blank組升高(P<0.05)，Rz-HIF-1a組較Ad-Blank組下降(P

9、有表達(dá)。 6、Western-blot定量結(jié)果顯示在56天長期缺血心肌中，外源性HIF-la蛋白基本無表達(dá)；各組ERK蛋白有弱表達(dá)，且無顯著性差異(P>0.05)，p-ERK無表達(dá)；VEGF蛋白的表達(dá)Ad-HIF-1a組、Ad-Blank組、Rz-HIF-la組較Sham組有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論： 1、腺病毒介導(dǎo)人HIF-1a基因轉(zhuǎn)染入缺血心肌后，RNA水平檢測到外源HIF-1a基因及其下游基