腺病毒介導(dǎo)的CTLA4Ig基因?qū)餐瑢?dǎo)入的其他外源性基因在脊髓表達的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用復(fù)制缺陷型重組腺病毒(Adenovirus,AdV)為載體將各種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)入脊髓以保護受損的神經(jīng)元和促進周圍神經(jīng)再生的研究，己成為神經(jīng)修復(fù)研究領(lǐng)域的前沿課題?；蛑委煹男Ч蕾囉趯⒛康幕蛱禺?、高效和安全的轉(zhuǎn)染受損神經(jīng)元及神經(jīng)并高效表達，但由于宿主對病毒載體的免疫反應(yīng)，使導(dǎo)入的基因不能在體內(nèi)長時間高水平表達，從而限制了導(dǎo)入基因的治療作用的發(fā)揮。本實驗將將攜帶LacZ基因的AdV(AdLacZ)與不帶外源基因的．AdO或

2、與攜帶有細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4immunoglobulin，CTLA4Ig)基因的AdV(AdCTIA4Ig)通過微量注射導(dǎo)入大鼠腰膨大脊髓實質(zhì)內(nèi)，比較共同轉(zhuǎn)染．AdCTIA4Ig后β-半乳糖苷酶(β-gal)在脊髓表達水平變化；并通過對脊髓淋巴細胞亞群分類染色的觀察、血清抗病毒抗體和中和抗體滴度檢測，以探討CTLA4Ig對AdLacZ

3、表達的影響及其誘導(dǎo)機體的免疫耐受的作用和機理。 方法：選用7周齡健康雌性Wister大鼠160只，體重200～250g。將大鼠隨機分成兩組，每組80只。對照組(A組)導(dǎo)入AdlacZ+AdO，實驗組(B組)導(dǎo)入AdlacZ+AdCTIA。將大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻(75-100mg/kg+5mg/kg)，麻醉成功后固定于腦立體定位儀上。取長約2cm后正中切口，去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-Ⅲ型手動

4、推進器，于脊髓后正中動脈旁開0．8mm處注射AdlacZ(1×10<'9>pfu/ml)和AdO(5×10<'9>pfu/ml)各1μl(A組)或AdLacZ(1×10<'9> pfu/ml)和AdCTLA(5×10<'9> pfu/ml)各1μl(B組)。針尖向頭側(cè)呈45度斜行進針，斜行刺入深度為2.5mm。注射速度為1μl/min，注射完畢后滯針5min，緩慢拔針。充分止血、沖洗傷口，局部噴灑抗生素預(yù)防感染，關(guān)閉傷口。兩組在轉(zhuǎn)染病毒

5、后12個不同的時間點鼠尾靜脈取血2ml；在轉(zhuǎn)染后10個不同時間點，對兩組動物脊髓進行厚50μm的連續(xù)冰凍橫切片，計數(shù)A組與B組中5-溴-4-氯-3-吲-口雜-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosideX-gal)染色陽性的切片數(shù)，分析比較兩組LacZ基因在脊髓表達的高峰期和持續(xù)時間；檢測血清抗病毒中和抗體滴度；通過脊髓切片淋巴細胞亞群分類染色，觀察CD68、CD4和

6、CD8淋巴細胞的浸潤情況。統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS12.0軟件，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間行成組比較t檢驗。P值<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果:1 共同轉(zhuǎn)染的AdCTIA對AdLacZ在脊髓表達的影響：A組在轉(zhuǎn)染后第一天即可觀察到β-gal的表達，藍染僅限于細胞核。轉(zhuǎn)染后第2天胞體和突起逐漸被藍染，轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)逐漸增多。轉(zhuǎn)染的高峰期為2～8天，持續(xù)時間為2周。B組在轉(zhuǎn)染后第一天即可觀察到β-gal和CTLA4Ig的表達，轉(zhuǎn)

7、染的高峰期為2～8天，B組的X-gal染色陽性表達時間約為4周。AdCTIA和AdLacZ基因轉(zhuǎn)染脊髓雙側(cè)的前角運動細胞和周圍的膠質(zhì)細胞。轉(zhuǎn)基因表達范圍局限于注射點上下各0.6cm區(qū)段，有轉(zhuǎn)基因表達的陽性冰凍橫切片數(shù)≤240片。轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元在注射同側(cè)表達較對側(cè)強烈。脊髓陽性切片計數(shù)顯示兩組β-gal在脊髓表達的高峰期均在2～8天，統(tǒng)計學(xué)分析表明兩組之間在高峰期間陽性切片數(shù)無顯著差異(P>0.05)。 2 共同轉(zhuǎn)染的AdCTLA

8、在脊髓對細胞免疫的影響： 淋巴細胞亞群分類染色觀察：A組在病毒導(dǎo)入后24小時內(nèi)即出現(xiàn)CD68浸潤，2天后開始出現(xiàn)CD8淋巴細胞浸潤，3天時開始出現(xiàn)極少量CD4淋巴細胞浸潤。病毒導(dǎo)入后6天CD68逐漸消退，免疫反應(yīng)則以CD8淋巴細胞浸潤為主，伴有極少量CD4細胞浸潤。在轉(zhuǎn)染后第8天CD8細胞逐漸增多，2周時達高峰，其浸潤程度較B組嚴重；持續(xù)到第6周時仍有少量浸潤。B組病毒轉(zhuǎn)染后1～6天，脊髓內(nèi)CD68、CD8和CD4細胞的浸潤程度

9、與A組相似。在轉(zhuǎn)染后第8天CD8細胞亦逐漸增多，2周達高峰；持續(xù)到第4周CD4、CD8細胞基本消退。兩組CD4細胞8天后均稍有增加但浸潤的數(shù)量都很少，并且與CD8消退的時間基本一致。 3 共同轉(zhuǎn)染的AdCTLA在脊髓對細胞免疫的影響： 抗病毒中和抗體滴度測定：A組轉(zhuǎn)染病毒后第3天血清中可檢測到抗病毒中和抗體，逐漸增加至第3周達到高峰并一直穩(wěn)定在這一水平直至第6周。B組在轉(zhuǎn)染后第3天，抗病毒中和抗體同樣也被檢測出，逐漸增加