腺病毒介導(dǎo)CTLA4Ig治療小鼠舍格倫綜合征的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：舍格倫綜合征(Sj(o)gren'ssyndrome，SS)是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，主要特征為累及唾液腺、淚腺等外分泌腺，引起腺體分泌功能障礙，出現(xiàn)眼干、口干等癥狀。主要發(fā)病機(jī)制為T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，其病理特征為外分泌腺淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺管擴(kuò)張，腺泡破壞。由于確切的發(fā)病機(jī)理還不清楚，目前沒(méi)有有效的治療措施。本實(shí)驗(yàn)用BALB/c小鼠創(chuàng)建SS的動(dòng)物模型，構(gòu)建CTLA4Ig(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4融合蛋白；cytotox

2、icTlymphocyticassociatedantigen4immunoglobulin)重組腺病毒載體(Ad-CTLA4Ig)并將其注入動(dòng)物體內(nèi)，觀察CTLA4Ig的基因轉(zhuǎn)染治療對(duì)SS免疫反應(yīng)的阻斷作用。從而為Ad-CTLA4Ig治療SS的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：構(gòu)建CTLA4Ig基因重組腺病毒，制作舍格倫綜合征小鼠的動(dòng)物模型，將腺病毒載體介導(dǎo)CTLA4Ig通過(guò)腹腔給藥途徑注入小鼠體內(nèi)，與胸腺肽治療進(jìn)行對(duì)比，觀察Ad-CTLA

3、4Ig對(duì)SS的治療效果。 方法： 本實(shí)驗(yàn)分三個(gè)步驟：1、CTLA4Ig基因重組腺病毒的構(gòu)建及擴(kuò)增：首先，應(yīng)用高效細(xì)菌內(nèi)同源重組系統(tǒng)，構(gòu)建了攜帶CTLA4Ig基因的重組腺病毒載體。酶切pCTLA4Ig基因和穿梭質(zhì)粒pAdTrack-cmv，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1在BJ5183感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行同源重組，脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，重組腺病毒在其中復(fù)制、擴(kuò)增。利用報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)可

4、以在熒光顯微鏡下直接觀察病毒的轉(zhuǎn)染和感染效率。經(jīng)反復(fù)感染-收集-凍融后，將感染后的293細(xì)胞裂解上清CsCl梯度離心純化，測(cè)定重組腺病毒pAdEasy-1/CTLA4Ig的病毒滴度；2、BALB/c小鼠SS動(dòng)物模型的建立：運(yùn)用BALB/c小鼠頜下腺組織勻漿與弗氏完全佐劑(CFA)混勻多點(diǎn)注射小鼠足墊，再注射百日咳疫苗加強(qiáng)免疫，誘導(dǎo)SS動(dòng)物模型；3、Ad-CTLA4Ig對(duì)SS的治療觀察：Ad-CTLA4Ig通過(guò)腹腔給藥阻止SS的病理過(guò)程，

5、與胸腺肽治療進(jìn)行對(duì)比，觀察頜下腺病理改變，周飲水量、靜態(tài)唾液總流率、外周血CD4+T細(xì)胞含量以及頜下腺AQP5表達(dá)量的變化，以此判定治療效果。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建CTLA4Ig基因重組腺病毒，測(cè)定重組腺病毒pAdEasy-1/CTLA4Ig滴度為5X1010pfu/ml。本實(shí)驗(yàn)所用的重組腺病毒在感染范圍內(nèi)，不會(huì)引起毒性反應(yīng)。 2.SS動(dòng)物模型制備結(jié)果：根據(jù)Chrisholm提出的SS病人唇腺活檢分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定

6、，模型組BALB/c小鼠全部發(fā)病，發(fā)病率為100％；臨床表現(xiàn)為唾液流率下降，周飲水量增加，出現(xiàn)口渴癥狀；病理表現(xiàn)為頜下腺組織中出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶，頜下腺導(dǎo)管擴(kuò)張，腺泡破壞，上皮島形成。 3.對(duì)比不同治療方法的治療效果： 3.1飲水量：測(cè)定每組最后1周的飲水量，與胸腺肽組及SS組比較，Ad-CTLA4Ig組小鼠周飲水量明顯減少，說(shuō)明有效的改善了小鼠的口渴癥狀。 3.2靜態(tài)唾液總流率：靜態(tài)唾液總流率可通過(guò)10min的

7、唾液總量來(lái)表示，Ad-CTLA4Ig組小鼠靜態(tài)唾液總流率明顯大于胸腺肽組及SS組，說(shuō)明小鼠唾液腺分泌功能得到明顯改善。 3.3病理檢查：切片顯示胸腺肽組與SS組小鼠在出現(xiàn)程度不一的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，頜下腺導(dǎo)管擴(kuò)張，腺泡破壞，上皮島形成。而Ad-CTLA4Ig組小鼠頜下腺病理改變明顯減輕。 3.4CD4+T細(xì)胞流式分析Ad-CTLA4Ig組小鼠的外周血CD4+T細(xì)胞含量接近正常，而與胸腺肽組及SS組外周血CD4+T細(xì)胞含量明顯

8、增高。 3.5APQ5蛋白印跡結(jié)果各組樣本中均檢測(cè)到AQP5的表達(dá)：出現(xiàn)分子量為27KD的條帶。小鼠頜下腺組織總蛋白Westernblot分析結(jié)果顯示，Ad-CTLA4Ig組AQP5的表達(dá)量與胸腺肽組及SS組比較顯著升高。 結(jié)論： 1.Ad-CTLA4Ig通過(guò)對(duì)T淋巴細(xì)胞的有效抑制，從而正向調(diào)節(jié)小鼠頜下腺AQP5的表達(dá)。 2.Ad-CTLA4Ig對(duì)SS治療效果明顯優(yōu)于胸腺肽，提示通過(guò)CTLA4抑制免疫反應(yīng)