CTLA4Ig對NK細胞功能調(diào)節(jié)及其在大面積燒傷治療中作用的實驗研究.pdf

1、大面積燒傷后，患者免疫應答低下(1，2)，容易發(fā)生感染，另一方面機體卻對皮膚移植物產(chǎn)生強有力的排斥反應，因此在不增加患者感染幾率的前提下提高異體皮的存活時間(即所謂免疫耐受的誘導)，是大面積燒傷治療的核心問題。 NK細胞作為天然免疫系統(tǒng)最重要的細胞在機體殺傷腫瘤細胞和抵抗病原體(病毒、細菌等)感染中發(fā)揮著重要作用。NK細胞的活化與否受控于NK細胞表面表達的抑制性受體(如NKG2A)和激活性受體(如NKG2D)的狀態(tài)。然而，在大面

2、積燒傷后，患者NK細胞毒性功能顯著下降(26，27)，是機體容易發(fā)生感染的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，院內(nèi)獲得性綠膿桿菌感染是燒傷感染和敗血癥發(fā)生的重要原因(3)。綠膿桿菌分泌的外毒素可抑制NK細胞毒性和IFN-y的分泌(4)，且對現(xiàn)在臨床使用的大部分抗生素均耐藥(5)。激活性受體NKG2D在NK細胞清除肺綠膿桿菌感染中起了關鍵作用(6，7)，那么NK細胞功能的增強是否會降低機體播散性感染發(fā)生的幾率呢？ 在免疫耐受誘導的研究中，20

3、年前發(fā)現(xiàn)的CTLA4以及在此基礎上制備的重紐融合蛋白CTLA41g最令人矚目。由于CTLA41g能高親和力地結(jié)合抗原遞呈細胞上的CD80/CD86，阻斷了共刺激信號，使T細胞不能接受第二信號，從而導致T細胞不應答，所以CTLA41g是T細胞活化中重要的負調(diào)節(jié)分子(8)。目前，CTLA41g的衍生物-Abatacept和Belatacept分別被用于治療自身免疫性疾病和控制器官移植免疫排斥反應(9-12)。我們的前期研究結(jié)果(13)和文獻

4、報道(14)也證實注射CTLA41g或創(chuàng)面局部應用CTLA41g重組腺病毒均可延長異體皮移植存活期，因此，CTLA41g如果可以應用于燒傷患者將會抑制移植物排斥反應，延長移植物的存活時間。那么，在燒傷情況下使用CTLA41g會加重燒傷后的病情和增加并發(fā)癥及死亡率嗎？ Abatacept是被美國FDA批準用于臨床治療類風濕關節(jié)炎的藥物，由人CTLA4分子胞外區(qū)和突變的IgGl Fc段融合而成。奇怪的是，這-T細胞強有力的抑制劑應

5、用于人體后，其腫瘤形成、病毒及細菌感染等副作用的發(fā)生率卻比預期大大降低(15-17)。亦有研究證實，小鼠全身應用兩倍劑量于人的藥物濃度時，并不影響其抵抗肺結(jié)核感染的能力，但這一有悖于常理的現(xiàn)象的機制和意義還是未知數(shù)(18)。UrsulaGrohmann發(fā)現(xiàn)，CTLA41g與DCs表面B7分子結(jié)合后，向DCs胞內(nèi)傳遞激活信號(19)。該研究說明，CTLA41g對表達CD80/CD86分子的細胞有調(diào)節(jié)作用。另有報道，天然免疫系統(tǒng)中最重要的細

6、胞-NK細胞表面也表達CD86分子，且在某些條件下可表達CD80分子(20，21)。Beissert S發(fā)現(xiàn)，長期暴露于紫外線中的CTLA41g轉(zhuǎn)基因小鼠，其皮膚腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于野生型小鼠(22)，事實上，NK細胞在皮膚癌細胞殺傷中發(fā)揮中重要作用(23)。綜上所述，CTLA41g可通過阻斷T細胞激活的共刺激信號通路抑制皮膚移植免疫排斥反應，其全身應用并不會顯著增加機體感染和腫瘤形成的風險.同時，CTLA41g可能對表面表達CD80/

7、CD86分子且在控制感染和腫瘤形成的其重要作用的細胞(如NK細胞)有調(diào)節(jié)作用(23）因此，我們提出如下科學問題：CTLA41g是否因為與NK細胞表面B7分子結(jié)合增強NK細胞毒性而造成機體清除皮膚癌細胞(或其他腫瘤細胞)能力的增強？其機制如何？這些怍用可否解釋CTLA41g在活體內(nèi)使用后并不顯著降低整體抵抗力的現(xiàn)象？ 本實驗通過體內(nèi)、體外試驗驗證CTLA41g對NK細胞功能是否具有調(diào)節(jié)功能，通過小鼠感染、燙傷和腫瘤模型驗證上述調(diào)節(jié)

8、作用，并初步探討其分子機制。從而深化對CTLA41g免疫調(diào)節(jié)作用的認識，并為CTLA41g應用于大面積燒傷治療提供理論基礎。我們將本研究獲得的主要結(jié)果和結(jié)論歸納如下： 一、CTLA41g及其衍生物Abatacept是NK細胞強有力的激活劑 1、CTLA41g在體外可明顯增強人PBMC和NK細胞功能； 2、CTLA41g(Abatacept)在體內(nèi)可顯著增強小鼠NK細胞毒性； 3、CTLA41g增強人NK細

9、胞毒性的作用是CTLA4分子依賴的； 4、CTLA41g(Abatacept)可增強機體抗腫瘤的能力。 二、我們對CTLA41g(Abatacept)在大面積燒傷治療中的新認識： 我們的前期研究結(jié)果(13)和文獻報道(14)都證實注射CTLA41g或創(chuàng)面局部應用CTLA41g重組腺病毒均可延長異體皮移植存活期，這就意味著CTLA41g如果可以應用子燒傷患者將會抑制移植物排斥反應，延長移植物的存活時間。因此，我們利

10、用綠膿桿菌感染模型和燙傷模型評價CTLA41g用于燒傷患者治療皮膚移植排斥反應的安全性，我們的研究首次發(fā)現(xiàn)使用Abatacept不僅可以顯著提高Balb/c小鼠清除綠膿桿菌的能力而且還能增強燙傷小鼠脾臟細胞的毒性，與體外的實驗結(jié)果一致。這一研究發(fā)現(xiàn)提示CTLA41g未來可用于大面積嚴重燒傷患者以誘導對皮膚移植物的免疫耐受，增強機體天然免疫力。這將是嚴重燒傷疾病治療的重大突破。 三、CTLA41g通過與NK細胞表面CD80/CD8

11、6分子結(jié)合上調(diào)激活性受體NKG2D和NKp44表達，增強NK細胞毒性功能： 1，CTLA41g通過與NK細胞表面CD80/CD86分子的結(jié)合促進NK細胞的毒性功能：本實驗研究抗CD80抗體和抗CD86抗體對NK細胞有無調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抗CD80抗體和抗CD86抗體在體外可明顯增強人PBMC對K562細胞的毒性，且與CTLA41g組NK細胞毒性無明顯差異。結(jié)合上述實驗結(jié)果我們認為，CTLA41g通過與NK細胞表面CD80/CD

12、86分子的結(jié)合促進NK細胞的毒性功能。 2，CTLA41g可上調(diào)NK細胞表面激活性受體NKG2D、NKp44的表達：我們采用流式細胞技術探討CTLA41g對NK細胞表面NKG2D和NKp44表達的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外加入CTLA41g后，人NK細胞表面激活性受體NKG2D、NKp44袁達明顯上調(diào)，且程度與IL-2相似。FcR受體與NK細胞結(jié)合不會導致NKG2D、NKp44表達上調(diào)。這一結(jié)果說明NK細胞表面激活性受體NKG2D、

13、NKp44的在CTLA41g增強NK細胞毒性功能的調(diào)節(jié)作用中可能發(fā)揮了重要作用。 總結(jié)： 一、CTLA4在體內(nèi)、體外均可增強NK細胞毒性； 二、CTLA41g通過與NK細胞表面CD80/CD86分子結(jié)合上調(diào)NK細胞表面NKG2D和NKp44的表達，增強NK細胞功能； 三、CTLA41g及其衍生物(如Abatacept)在全身應用，可增強小鼠抗腫瘤和抗感染的能力，不增加患者罹患腫瘤及感染的幾率，擴大了其臨床